学年人教版高中生物选修一专题5 DNA和蛋白质技术 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段 Word版含答案Word文档格式.docx
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引物
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
2.PCR扩增的原理及条件
(1)PCR技术:
即多聚酶链式反应,是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。
它能以极少量的DNA为模板,在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。
(2)引物:
DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,而只能从3′端延伸DNA链,因此,DNA复制需要引物。
(3)扩增方向:
总是从子链的5′端向3′端延伸。
(4)原理:
DNA的热变性原理,即:
双链DNA单链DNA
(5)条件
3.PCR的反应过程
(1)过程:
(2)结果:
DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列,使这段固定长度的序列呈指数扩增。
1.DNA复制时为什么需要引物?
提示:
DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,而只能从3′端延伸DNA链。
2.PCR扩增DNA过程中是否还需要解旋酶?
不需要。
3.PCR缓冲液相当于细胞内的什么成分?
因为缓冲液为DNA的复制提供场所,相当于细胞内DNA复制的场所,所以缓冲液相当于核基质。
4.PCR循环之前,常要进行一次预变性,预变性的目的是什么?
预变性的目的是增加大模板DNA彻底变性的概率。
5.利用PCR技术扩增1个DNA分子n次,所得DNA分子中,不含引物的脱氧核苷酸链所占的比例是多少?
含引物的DNA分子所占的比例是多少?
1/2n;
100%。
[跟随名师·
解疑难]
1.细胞内DNA复制与体外DNA扩增(PCR技术)的比较
项目
细胞内DNA复制
PCR
不同点
解旋
解旋酶,边解旋边复制
80~100℃高温解旋,双链完全分开
DNA解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶
TaqDNA聚合酶
RNA
DNA或RNA
温度
体内温和条件
高温
子链合成
一条链连续(先导链),另一条链不连续,先合成片段,再由DNA连接酶连接(滞后链)
两条子链均连续合成
相同点
①提供DNA模板
②四种脱氧核苷酸作原料
③子链延伸的方向都是从5′端到3′端
2.PCR反应过程
(1)变性:
当温度上升到90℃以上时,双链DNA解聚为单链,如图:
(2)复性:
系统温度下降至50℃左右时,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合,如下图:
(3)延伸:
当系统温度上升至72℃左右,溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、G、C)在DNA聚合酶的作用下,据碱基互补配对原则合成新的DNA链,如下图:
[特别提醒]PCR反应的结果
①PCR一般要经历三十多次循环,每次循环都包括变性、复性、延伸三步。
②两引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增。
实验操作及DNA含量的测定
1.实验操作程序
2.DNA含量的测定
(1)原理:
利用DNA在260_nm的紫外线波段的吸收峰曲线来测定相应含量。
(2)计算公式:
DNA含量(μg/mL)=50×
(260nm的读数)×
稀释倍数。
1.实验操作注意事项
(1)为避免外源DNA等因素的污染,实验中使用的一些用具在使用前必须进行高压灭菌。
(2)所用的缓冲液和酶应分装成小份,并在-20℃储存。
(3)在微量离心管中添加反应成分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头必须更换。
所有成分都加入后,通过手指轻轻弹击管的侧壁,使反应液混合均匀。
2.结果分析与评价
DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰,可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定,以判断DNA片段的扩增是否成功。
具体方法如下:
(1)稀释:
取2μLPCR反应液,加入98μL蒸馏水,即将样品进行50倍稀释。
(2)对照调零:
以蒸馏水作为空白对照,在波长260nm处,将紫外分光光度计的读数调节至零。
(3)测定:
取DNA稀释液100μL至比色杯中,测定260nm处的光吸收值。
(4)计算:
检测DNA片段的扩增情况,可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果,计算公式为:
稀释倍数
如果扩增不成功,则要分析失败原因。
可能的原因有:
漏加了PCR的反应成分,各反应成分的用量不当,PCR程序设置不当等。
[特别提醒] 公式中的50代表在波长260nm紫外波段照射下,吸收峰为1时,DNA含量为50μg/mL。
PCR技术的原理
[例1]多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。
PCR过程一般经历下述三十多次循环:
95℃下变性(使模板DNA解旋)→55℃下复性(引物与DNA模板链结合)→72℃下延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。
下列有关PCR过程的叙述中错误的是( )
A.变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键,生物体内复制时是通过解旋酶实现的
B.复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的
C.延伸过程中需要DNA聚合酶和四种核糖核苷酸
D.PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高
[解析] 变性是为了使DNA内部的氢键断裂,双螺旋打开,体内复制时借助解旋酶来实现;
借助碱基互补配对原则,引物可与DNA模板链结合;
延伸时是形成新的DNA分子,需要以脱氧核苷酸为原料;
PCR过程的温度高,会导致一般的DNA聚合酶失活,需特定的耐高温DNA聚合酶。
[答案] C
归纳拓展
(1)DNA母链的3′端对应着子链的5′端,即DNA的两条链是反向平行的。
(2)解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开,而DNA聚合酶与DNA连接酶都是催化形成磷酸二酯键的。
(3)DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3′端上,需要模板;
而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口,不需要模板。
PCR反应过程及产物
[例2]在遗传病及刑侦破案中常需要对样品DNA进行分析,PCR技术能快速扩增DNA片段,在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝,有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。
据图回答相关问题:
a链5′-G-G……T-C-3′ 5′-G-G-OH(引物Ⅰ)
b链3′-C-C……A-G-5′ (引物Ⅱ)
95℃↓
5′-G-G……T-C-3′ 3′-C-C……A-G-5′
55℃↓
5′-G-G-OH
72℃↓
________________ ________________
(1)在相应的横线上写出引物Ⅱ,并在复性这一步骤中将引物Ⅱ置于合适的位置。
(2)在相应的横线上写出循环一次后生成的DNA分子。
(3)若将作为原料的四种脱氧核苷酸用32P标记,请分析循环一次后生成的DNA分子的特点是______;
循环n次后生成的DNA分子中不含放射性的单链占总单链的比例为______。
[解析]
(1)DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从3′端延伸DNA链,引物就提供了3′端。
子链延伸方向为5′→3′,引物Ⅰ与b链部分碱基互补,引物Ⅱ则与a链部分碱基互补,且连接到a链的3′端,故引物Ⅱ的结构为5′-G-A-OH,复性结果为:
HO-A-G-5′
5′-G-G……T-C-3′。
(2)经过一次循环后,产生的两个DNA分子分别含有引物Ⅰ和引物Ⅱ。
(3)由于作为原料的四种脱氧核苷酸被32P标记,所以新合成的子链均含有放射性,一次循环后的两个DNA各有一条链含32P,若复制n次,产生子链共2n×
2,其中只有亲本的两条母链不含32P,则其所占比例为2/(2n·
2)=1/2n。
[答案]
(1)5′-G-A-OH
a链5′-G-G……T-C-3′
HO-A-G-5′
(2)5′-G-G……T-C-3′ 3′-C-C……A-G-5′
3′-C-C……A-G-5′ 5′-G-G……T-C-3′
(3)每个DNA分子各有一条链含32P标记 1/2n
[随堂基础巩固]
1.下列说法错误的是( )
A.一条DNA母链只有一个3′端,即羟基末端
B.DNA的两个3′端位于相反的两端
C.TaqDNA聚合酶只能与引物的3′端结合并延伸子链
D.DNA的合成方向是从子链3′端向5′端延伸的
解析:
选D 我们通常将DNA单链的羟基(—OH)末端称为3′端,而磷酸基团的末端称为5′端,一个DNA分子有两个3′端和两个5′端,它们分别位于DNA分子的两端,即每一端都有一个3′端和一个5′端。
TaqDNA聚合酶只能与引物的3′端结合并开始延伸DNA链,即子链总是从5′端向3′端延伸。
2.标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步,这三大步需要的温度依次是( )
A.92℃、50℃、72℃ B.72℃、50℃、92℃
C.50℃、92℃、72℃D.80℃、50℃、72℃
选A 当温度上升到90℃(90~96℃)以上时,双链DNA解聚为单链,称之为变性;
当温度下降到50℃(40~60℃)左右时,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合,称为复性;
当温度上升到72℃左右(70~75℃)时,溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在TaqDNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链,称为延伸。
3.使用PCR仪的具体实验操作顺序应为( )
①设计好PCR仪的循环程序
②按配方准备好各组分
③用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分
④进行PCR反应
⑤离心使反应液集中在离心管底部
A.②③⑤④①D.①⑤③②④
C.②③⑤①④D.④②⑤③①
选C PCR反应的操作步骤一般分为准备(包括配制配方及将各配方放于实验台上)―→移液―→混合―→离心―→反应。
因PCR仪是一种自动控制温度的仪器,设计好循环程序就可以进行反应了。
4.下列对操作过程的叙述,错误的是( )
A.PCR反应中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌
B.PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份,并在-20℃储存
C.PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后,迅速融化
D.在微量离心管中添加反应成分时,每吸取一种试剂后,移液器上的吸液枪头都必须更换
选C 为了防止外源DNA等因素的污染,PCR反应中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌;
所用的缓冲液及酶应分装成小份保存,并使用一次性吸液枪头,即A、B、D均正确。
在冰箱中放置的缓冲液和酶取出后应放在冰块上缓慢融化,而不能迅速融化,故C错误。
5.PCR(多聚酶链式反应)技术是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术,下图表示合成过程,请据图分析回答问题:
(1)A过程高温使DNA变性解聚,对该过程原理的叙述,正确