hanks液的配制细胞培养技术文档格式.docx
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如心肌组织中心肌细胞约占50％，非心肌细胞占50％；
而经纯化分离的心肌细胞悬液中，心肌细胞可达95％以上，这样，心肌细胞原代培养实验基本不受其它细胞的干扰。
在细胞培养实验中能直接观察到培养细胞生命活动的动态过程；
用定时显微摄影记录可发现一些肉眼观察不到的生命现象；
还可利用电镜手段、同位素标记、放免法和免疫组化法等来研究细胞形态结构及细胞内化学物质的分布。
此外，还能节约研究费用。
如在某些研究中，用100只动物做实验所获得结论与用100张盖玻片或几十个培养瓶而获得结论具有相同的统计学意义，而细胞培养较之大批量的动物饲养花费要小。
但细胞培养方法也存在不足之处：
培养细胞失去体内细胞的制约和整体的调节作用，细胞形态和功能会发生一定程度的改变。
培养方法、实验试剂对细胞形态和功能有一定的影响，如胰蛋白酶可破坏细胞表面受体、酶、抗原等。
长期体外培养的细胞，由于反复传代、冻存和操作等因素的影响，可能发生染色体非整倍体改变，呈永生化或癌变的特征。
二.细胞培养的基本设备与用品
（1）
细胞培养的基本设备
细胞培养的基本设备有：
CO2培养箱，倒置显微镜，净化台，压力蒸汽消毒器，自动双重纯水蒸馏器，液氮罐，冰箱，电热干燥箱，电热恒温培养箱，电动吸引器，抽气泵等。
（2）
常用的实验用品
1.
玻璃器皿
细胞培养所用的玻璃器皿应由透明度好、无毒的中性硬质玻璃制成。
常用的有以下几种：
国产螺旋口培养瓶[有12．5毫升，25毫升，100毫升等规格，国外培养瓶常以底面积（平方厘米）表示]；
培养皿（直径有3．5厘米，6厘米，9厘米，10厘米等规格）；
离心管（5毫升，10毫升）；
注射器（1毫升，5毫升等）；
用生理盐水瓶代替的贮存瓶（100毫升，250毫升，500毫升）；
青霉素瓶（5毫升）；
西力辛瓶（10毫升）；
其它还有尖吸管和移液管，载玻片（厚度0．8～1．2毫米），盖玻片（厚度0．12毫米），贮存尖吸筒用的玻璃筒或金属筒，漏斗，烧杯，量筒，贮蒸馏水瓶，冷冻管（1．5毫升，2毫升）等。
2.
塑料品
多孔培养板规格有4、6、12、24、96孔等，培养皿直径有3厘米、6厘米、10厘米等。
塑料品经消毒灭菌密封包装，供一次性使用，重复使用的需经特殊方法清洗消毒。
塑料器材厚薄均匀，有的表面经特殊处理，细胞易于生长。
3.
器械
解剖刀、眼科剪和镊（直头和弯头）、中号圆头镊、止血钳等。
4.
杂用品
金属饭盒、试管架、各种规格胶塞、记号笔、搪瓷盘、吸头（吸取液体的胶帽）、酒精灯、酒精、碘酒棉球瓶、火柴等。
组织培养中使用最多的是吸管、培养瓶、培养皿及各种瓶塞。
实验者手中应有三套器材，瓶塞数要大于瓶数，才能保证实验中的循环使用。
三.细胞培养用品的清洗与消毒灭菌
清洗
常用玻璃器皿清洗
◇
清洗要领
浸泡
初次使用的玻璃器皿呈碱性，表面常附有灰尘和一些对细胞有毒的物质，如铝和砷等。
空气湿度高时，玻璃器皿表面又易长霉。
使用前，新器皿浸泡在5％稀盐酸中过夜，以中和玻璃表面的碱性物质并去除霉斑；
然后经简单刷洗，流水冲洗（逐片进行），蒸馏水浸泡，干燥备用。
新玻片处理后，短时间不用时，需将它投入95％的酒精中保存，以防玻片长霉。
培养后的玻璃器皿应立即投入清水中浸泡，器皿中残留的细胞、蛋白质一旦干涸，即固着于玻璃表面，极难脱落。
刷洗
用过的玻璃器材经自来水冲洗后，浸入水中煮沸，然后将适量洗涤剂（洗洁精或洗衣粉）投入沸水中继续煮沸10分钟，趁热刷洗器皿内外，刷洗后浸入清水中进行冲洗。
酸泡
刷洗好的玻璃器材干燥后置清洁液中浸泡24小时，清洁液的强氧化作用可清除刷洗不掉的极微量杂质。
清洗步骤
玻璃器材煮沸10分钟→刷洗→流水振荡冲洗15-20遍→50℃烤干→清洁液浸泡24小时→流水振荡后冲洗15-20遍→漓水→蒸馏水浸泡2次（每次24小时）→50℃烤干，待包装。
清洗注意事项和要求
①
使用后的实验器材应立即投入清水中。
②
浸泡、煮沸、酸泡的器皿内要充满液体，不得有气泡。
③
刷洗、酸泡后的器材要用流水振荡冲洗，不得残留洗涤剂、清洁液。
方法是：
每瓶灌2／3容积
的自来水，振荡后倒掉，重复15—20次（尖滴管置量杯中冲洗）。
④
煮沸前的水面要高于器材5厘米，水沸后投入洗涤剂（直径35厘米的铝锅，用洗衣粉10克左右）。
若洗涤剂和实验器材同时从冷水煮至沸腾或使用过量洗剂，均易腐蚀玻璃表面，使玻璃碱化，
pH值上升。
⑤
软毛刷的刷端已掉毛的应该弃去，否则会损害玻璃。
玻璃划痕处易残留洗涤剂，会改变培养液
pH值和毒害细胞。
⑥
清洁物品应及时包装消毒，应注意妥善保存，防止落入灰尘、蟑螂、蚂蚁等引起二次污染。
⑦
使用后的胶塞与玻璃器材同时煮洗时，胶塞要放在煮锅的底部。
⑧
浸泡器材的蒸馏水容器要专用，并做好标记，如“蒸馏水Ⅰ盆”、“蒸馏水Ⅱ盆”。
⑨
器材清洗干燥后，在以后各步操作时，手指不可接触器材的使用端。
清洗者可戴一次性薄膜手
套进行操作，省时又保证清洗质量。
⑩
用超声波仪清洗器材时，清洗要求同上。
橡胶制品的清洗
新购置的橡胶制品（胶塞、胶管、橡皮乳头）的洗涤方法如下：
0．5摩尔/升NaOH煮沸15分钟→流水冲洗→0．5摩尔/升HCl煮沸15分钟→流水冲洗→自来水煮沸2次→蒸馏水煮沸20分钟→50℃烤干备用。
这样处理可完全除净胶塞上的硫磺等有毒物质。
用过的胶塞，其清洗方法、要求基本同玻璃器材。
因胶塞使用面常沾有洗涤剂，流水冲不净，故胶塞洗刷的重点部位是胶塞使用面，用刷逐个刷洗。
在使用过程中，胶塞不能与培养液接触，以防未洗净的胶塞污染培养液和细胞。
3．
G6除菌滤器的清洗
新G6除菌滤器置玻璃洗液中浸泡24小时，流水缓慢冲洗，至pH值为5．5左右，然后用4倍的蒸馏水缓慢冲洗，再用重蒸馏水缓慢冲洗，烤干，包装消毒备用。
用过的G6除菌漏斗立即浸泡水中（注意：
滤器千万不能干涸）过夜，流水缓慢冲洗24小时或更长时间，至滤面基本疏通时，50℃烤干，滤器再置清洁液中浸泡24小时，或装满清洁液自然过滤。
流水冲洗及其后的处理同新G6除菌滤器。
正压除菌滤器的清洗
新的或使用后的正压滤器经稀洗涤剂刷洗一流水冲洗15分钟→漓水→去离子水浸泡24小时→三蒸水浸泡24小时→干燥备用。
5.
塑料制品的清洗
塑料制品质地软且耐腐蚀能力强，但不耐热，易出现划痕。
其清洗程序为：
器皿用后立即用流水冲洗→浸于自来水中过夜→用纱布、棉签和50℃稀洗液刷洗→流水冲洗（人工冲洗15—20遍）→晾干→浸于清洁液中15分钟→流水冲洗→蒸馏水浸泡两次（每次24小时）→晾干备用。
6.
清洗液的配制
清洁液
新配制的清洁液为棕红色，遇有机溶剂或水分增多时变成绿色，表明失效。
先在搪瓷盆中加入蒸馏水，加热溶解重铬酸钾，再将盆置流动自来水中，待重铬酸钾液冷却后，缓慢加入浓硫酸，边加边用玻棒搅动，以混合液温度不过快上升和不出现重铬酸钾结晶为度。
玻璃滤器洗液
取10克硝酸钠和28．6毫升浓硫酸，放入盛有470毫升蒸馏水的玻璃缸内混匀备用。
清洁液配方
配方成分
常用方
弱液
次强液
强液
重铬酸钾（g）
100
50
60
清水（ml）
800
1000
200
浓硫酸（ml）
90
160
硫酸浓度（v/v）
20%
8%
14%
80%
消毒灭菌
湿热消毒
湿热消毒的要求
使用压力蒸汽灭菌器进行湿热消毒。
消毒物品不能装得太满，物品之间应留有空隙，以利于消毒器内蒸汽的流动。
排气管要插入消毒器的槽内。
若排气管断裂，要将排气管与排气阀调至同一位置。
玻璃器材使用端（管口、瓶口）要向下放置。
液体消毒时，用棉塞或插有针头的胶塞封瓶口。
加热前将放气阀摘子置垂直位（开放），消毒器内空气随温度升高由此阀孔逸出，容器内冷空气
随之排出。
当水煮沸时，有一股较急的蒸汽冲出时，将放气阀摘子置水平位（关闭）。
排除冷空
气的另一种方法是：
放气阀摘子置水平位（关闭），加热，压力升至5磅时，将摘子置垂直位（开
放），冷、热空气先后排出（可用手试）。
待压力指针回归零位时，放气阀摘子再置水平位（关
闭）。
继续加热，当消毒器内升压至需要压力时，计时并使压力恒定。
压力维持方法：
用电加热时，
可通过电源和灭菌器间的稳压器调节；
没有稳压器时，用放气阀摘子自动排气调节；
用煤气加
热时，可调节火力维持压力。
根据消毒物品种类不同所选择的消毒压力和时间也不同，一般物
品（如布类、金属器械、玻璃器皿等）消毒的要求是15磅20分钟；
橡胶制品为10磅10分钟；
常规
液体消毒15磅15分钟。
一般认为在这种压力下1分钟内几乎可杀死所有微生物，但由于消毒物品
的包装内仍可能留有冷空气，而使高压蒸汽不能达到消毒器的各部分，所以要延长消毒时间。
消毒完毕，待压力指针降至零位，再等数分钟，待放气阀摘子放完气后打开消毒器盖。
液体瓶
口棉塞换胶皮塞或拔去胶皮塞针头换新塞。
湿热消毒的注意事项
不可用安全阀摘子排气。
消毒的过程中若出现漏气现象，可调节消毒器盖内的胶垫的位置。
灭菌完毕，不要急于取出消毒品，可利用消毒器的余热去除物品部分湿气，待半小时左右再移
入干燥箱烘干。
干热消毒
这种消毒方法主要用于玻璃器皿消毒，一般温度在160℃维持90—120分钟就可以杀死芽胞，达到消灭包括细菌、芽孢在内的一切微生物的目的，还可破坏热原质。
消毒完毕，待烘箱内温度冷却后再开门，避免因冷空气突然进入，烘箱内温度骤降引起玻璃器皿损坏。
紫外线消毒
紫外线直接照射消毒是各实验室常用的方法，主要用
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