胰酶制备新工艺研究Word文件下载.docx

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　　关键词 

猪；

胰腺；

胰酶；

胰蛋白酶；

胰淀粉酶；

胰脂肪酶

　　Preparationofpancreatinfromswinepancreas

　　WUXiaoying,ZHANGJubao,LINYing,LIANGHueiyi,LIYanqi

　　（Dept.ofBioengineering,SouthChinaUniversityofTechnologyAndEngineering,Guangzhou510640,China）

　　Abstract 

ObjectiveTostudythenewprocessingtechniqueofpancreatinfromswinepancreas.MethodsUsed%isopropylalcoholasextractingsolvents;

added%CaCl2+1%pancreatinasprotectingagents;

regulatedpH~withNaHCO3;

extractingtime3h.ResultsUnderoptimumconditions,pancreatinwithhighactivityandyieldwasobtained.Theactivitiesoftrypsin,lipaseandamylopsinwereover5200u/g,57300u/gand37000u/grespectively,andtheyieldwas10%~12%.ConclusionItisasimpleandtimesavingtechniqueforthepreparationofpancreatinwithhighpurity,highactivityandhighyield.

　　Keywords 

swinepancreas;

pancreatin;

trypsin;

steapsin;

amylopsin

　　胰酶是从猪、牛、羊等哺乳动物的胰腺中提取取得的一种混合酶制剂，主要成份为胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶，还有羧肽酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、激肽释放酶和核糖核酸酶等。

胰酶系我国和国际上多国药典收载的助消化药品，用于医治消化不良、食欲不振及肝脏疾患引发的消化障碍等。

另外，由于胰酶中含有多种活性成份，可作为原料药从中提取所需生化物质。

同时，工业胰酶普遍用于皮革加工，它优于其他微生物来源的蛋白酶，对皮革的软化、脱脂、松紧度起较好的调节作用。

国内外对胰酶的需求量较大。

　　从猪胰腺中提取胰酶的工艺已有很多报导［1~4］，但活性和收率不尽满意，为更充分利用有限的胰腺资源，参照国内外的文献［5~7］，比较了不同提取工艺的优缺点，对胰酶制备的多种条件如激活剂、提取溶剂、保护剂、激活时刻和酸度等进行探索，成立一条利用稀异丙醇从猪胰腺中提取胰酶的新工艺。

　　1 

材料与方式

实验材料 

　　猪胰腺、十二指肠、苦胆均由广州茅山肉联厂提供，在屠宰后1h内放入冰盒中保温，在3h内胰腺和十二指肠放入－20℃冰箱中冷冻，胆汁置细口瓶中在4℃冰箱中保留。

试剂 

　　酪蛋白，供胰酶测定专用，中国药品生物制品检定所提供；

马铃薯淀粉，生化试剂；

其他试剂均为分析纯。

仪器 

　　756MC紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；

LD5-2A医用离心机，北京医用离心机厂；

PHS-3C型pH计，上海精密科学仪器有限公司雷磁仪表厂；

WX-2型真空泵，临海市精工真空设备厂；

ZK82B真空干燥箱，上海实验仪器厂。

测定方式 

　　胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶的酶活力测定和炽灼残渣、干燥失重均按中国药典［8］方式进行。

大体工艺

　　冻胰，绞碎适量稀异丙醇 

保护剂、激活剂 

调pH 

25℃下搅拌激活胰浆φ=30%~35%异丙醇 

过滤 

提取液

φ=55%~65%异丙醇 

沉淀物丙酮 

真空干燥胰酶成品

　　2 

结果与讨论

激活剂种类和用量的影响

　　一般的胰酶制备工艺中，蛋白酶的激活，多采用自溶与加激活剂相结合的方式，激活剂包括Ca2+、胰酶粉、胆汁、十二指肠等，一般采用两种以上的激活剂，其中钙离子是必不可少的，因为胰蛋白酶原活化后进一步反映生成无活性的蛋白，加入mol/LCa2+能够加速酶原活化而抑制副反映的发生，提高收率，同时Ca2+又能激活脂肪酶。

缺点是Ca2+亦是引发胰酶炽灼残渣增高的主要原因，而苦胆却能克服这一缺点。

苦胆与Ca2+对酶活、收率及炽灼残渣影响的对比实验结果见表1。

表1 

Ca2+与苦胆激活效果的对比（略）

　　实验证明，苦胆激活的确能够减少炽灼残渣的量，但却可能引发酶活力损失，Ca2+激活所引发的炽灼残渣的量比苦胆激活稍高，但酶活力却取得较好的维持。

因此，试图通过增加胰酶粉的加入量，减少Ca2+加入量，提高酶的活力。

本文考察，当CaCl2加入量固定为胰浆重量的%的条件下，不同胰酶粉的加入量对提取效果的影响。

　　当胰酶粉的加入量为胰浆重量的%时，酶活力与收率都偏低，而胰酶粉的加入量为胰浆重量的1%时，激活效果较好。

因此，以后的实验都采用02%的CaCl2和1%的胰酶粉为激活剂。

保护剂对酶活力与三酶比例的影响 

　　为了减少酶活损失，加入保护剂是必要的，目前国内对添加保护剂的研究不多，1999年的美国专利［9］列举了一系列的胰酶的保护剂，例如淀粉、麦芽糖、阿拉伯胶、山梨醇、牛血蛋白、甘油、盐等，也可用葡萄糖酸钙，既起激活效果，又达到保护的目的。

一般淀粉是首选，它对淀粉酶有专门好的保护作用，而淀粉酶的降解速度比脂肪酶和蛋白酶快很多。

本研究选取淀粉、麦芽糖、氯化钠作为保护剂，并比较保护剂对酶活和三酶比例的影响。

　　从表2能够看出不加保护剂时所得胰酶制品的胰蛋白酶活性较高和炽灼残渣都比较低，但胰脂肪酶、胰淀粉酶的酶活较低。

加保护剂后三酶比例比较合理，炽灼残渣也大体符合标准。

可见，加入必然量的保护剂对保证胰酶的质量是必要的。

表2 

保护剂对酶活与三酶比例的影响（略）

　　以往的研究表明［2］，胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶在激活时出现活力峰值的时刻不同，所以为保证产品中三酶活力较高，往往采取添加保护剂的方式，使得即便超过激活时刻，酶活的损失较少。

这与实验结果也是吻合的，也证明加入保护剂的必要性。

可是，保护剂的作用有限，它并非能避免酶原进一步水解，避免酶活力的回落。

但它对酶活力损耗的延迟作用给生产带来专门大方便，同时提高了成品酶的活力。

异丙醇浓度对提取效果的影响

　　国内的胰酶制备工艺一般利用乙醇为提取溶剂［1-4］，但乙醇对胰脂肪酶的活性有影响，本研究采用稀异丙醇为提取溶剂。

　　异丙醇对胰酶的提取起到关键的作用：

①自溶，即促使胰酶从胰浆中充分地释放出来；

②抑菌，动物胰腺中生长着很多菌群，提取时易残留在胰酶产品中，使胰酶中含菌量超标，适当浓度的异丙醇对菌群的生长起抑制作用并可将某些菌杀死，专门是存在于自溶初期处于敏感状态的生殖细胞，因为它能够破坏某些菌的DNA结构并将其降解掉；

③降低胰浆的黏度，有利于下一步的操作，又可减少胰酶残留，有利于胰酶释放。

本研究对异丙醇浓度为5％，%，10％,20％对提取效果的影响做了探讨，从图2能够看出，最佳的异丙醇浓度为%，在该浓度下所得的胰酶中蛋白酶酶活和收率都较高，同时消耗的异丙醇用量也少，节省本钱。

pH对提取效果的影响

　　胰酶可在酸性或碱性条件下提取，一般加入适量的盐酸，在pH4～6进行提取，可提高收率，但需要较长的提取时刻；

而在pH6～8时胰蛋白酶自身催化反映速度最快，可缩短提取时刻，但易引发酶活损失，因此必需控制好自溶时刻以防胰酶的自身降解，也可通过加入保护剂以减少它的自身降解速度。

　　本研究对提取体系的pH别离为、、、对提取效果的影响做了探讨，结果如图3所示，最佳的提取pH为，现在所得的胰蛋白酶活力和收率都较高。

同时，在实验进程中发觉提取体系的pH会随提取时刻的延长而有所下降，因此本研究通过加入NaHCO3来代替传统工艺中的NaOH,在体系中起pH缓冲作用，使pH稳固在~之间，以保证提取效果。

提取时刻对提取效果的影响

　　控制好适当的提取时刻是取得高酶活、高收率胰酶的关键，目前报导的工艺中自溶或提取时刻各异，有的只需3～4h，有的需放置留宿，乃至4～7d，依不同的工艺而定。

由于本工艺采用的是碱法提取，所需的提取时刻相对较短，本研究对提取时刻为2h、3h和4h对提取效果的影响做了探讨。

从图4能够看出最佳的提取时刻为3h。

补加异丙醇工艺条件的肯定

　　当达到最佳自溶时刻时，胰酶正处于高速自溶、极为敏感的状态，可通过加入适量的异丙醇使胰酶的自溶停止以避免其自身破坏作用。

本实验通过加入必然量异丙醇使体系中异丙醇浓度为30％～35％可使自溶停止，同时又可使胰浆的黏度大大地降低从而有利于除去纤维残渣，而不会引发较大的酶收率损失，省去二次提取的本钱。

胰酶的沉淀与脱脂

　　2.7.1 

沉淀剂浓度的肯定

　　本研究所采用的异丙醇浓度为55％～65％，若小于55％则收率降低，若高于65％则会引发胰酶的抑制反映使蛋白酶的活力降低。

而且最好用冷至4℃以下的异丙醇沉淀，以加速沉淀速度，缩短沉淀时刻，减少酶活的损失。

　　2.7.2 

胰酶脱脂

　　本研究所采用的脱脂剂为冷丙酮。

脱脂方式是用冷至4℃以下的丙酮洗涤离心所得的产物，以后进行抽滤，然后再用丙酮分2～3次进行洗涤。

脱脂是影响产品外观和产品产率的重要因素，所以应尽可能做到脱脂完全。

优化工艺的验证明验

　　按上面的优化工艺条件，咱们制备了3批胰酶，并进行了测定，结果如表3。

表3 

优化工艺所得胰酶的测定结果（略）

　　3 

结论

　　本研究通过对从猪胰腺中提取胰酶的工艺进行探讨，肯定优化工艺为：

利用φ=%异丙醇为提取溶剂，添加ρ=%的CaCl2和φ=1%的胰酶粉为激活剂和适量的保护剂，并加入NaHCO3使体系的pH稳固在~之间，在室温下提取3h，通过加入适量异丙醇使体系中异丙醇体积分数为30％～35％使自溶停止，过滤，于滤液中加入适量异丙醇使体系中异丙醇体积分数为55％～65％使胰酶沉淀，用冷丙酮脱脂，40℃下真空干燥。

在优化工艺条件下，制备的胰酶制品的胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶的酶活力别离达5200、57300、37000 

u/g以上，为中国药典所规定的最低酶活的8~10倍，平均收率10%以上，同时胰酶制品的炽灼残渣也符合出口要求。

　　本研究的制备胰酶的新工艺具有工艺简单、提取效率高、产品酶活高、本钱低、生产周期短的特点，有良好的推行应用前景。

　　参考文献

　　［1］傅渝滨，李勤耕，邓春平，等.从猪胰脏中提取胰酶的优化工艺探索［J］.重庆医科大学学报，1995,20（4）:

305.

　　［2］何执中，何执静.高活力