最新猪常见病PCR检测程序Word文档格式.docx

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1、阳性对照RNA的提取

材料冻干猪瘟兔化弱毒疫苗、检测用病毒RNA提取试剂盒（天跟公司产品）。

方法将1瓶猪瘟兔化弱毒冻干疫苗用1.5ml蒸馏水或PBS液稀释，用1mlRNase-free管分装，每管500µ

l，-20℃保存。

取出冻存的猪瘟病毒，解冻后离心，取上清用于RNA的提取。

RNA提取按试剂盒说明进行，最后用50µ

lRNAase-free水溶解RNA，得到RNA溶液。

2、疑似病料RNA的提取

样品采集采集病死或扑杀的猪，取血清、扁桃体、淋巴结（包括肺门、腹股沟和肠系膜淋巴结）、肺脏、脾脏、肾脏、流产胎儿等组织病变与健康部交界处组织；

待检活猪，用注射器取血5ml，4℃保存，送检（病料要新鲜，严禁反复冻融病料）。

附：

通常木乃伊胎不能作为检测样品。

对于新鲜流产的胎儿，可作为检测样品。

对于流产日龄较早的胎儿，可取整个胎儿保存；

如果是晚期流产的胎儿，最好根据上述步骤，摘取相应组织，保存送检。

胎儿的保存方法同上。

组织样品处理称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mlPBS（PH7.2）继续研磨制成1:

3的组织匀浆液，转至1.5ml灭菌离心管中，8000r/min离心2min，取上清液用于RNA的提取；

全血样品处理：

待血凝后取血清用于RNA的提取。

RNA提取待检样品RNA的提取按试剂盒说明进行，最后用50µ

二、RT-PCR反应

1、材料RT试剂盒（东洋纺产品）、PCR试剂盒（天跟公司产品）。

引物序列：

F：

5’-GACCTGGATGCGACTGACC-3’,19bp，TM为61.88。

R：

5’-GCGGCGAGTTGTTCTGTTAG-3’,20bp，TM为59.85。

扩增的目的片段为133bp。

2、RT体系及反应程序：

名称

弱毒疫苗阳性对照

检测病料

RNase-Free水

6µ

l

特异性下游引物

1µ

模板RNA

5µ

11µ

Total

12µ

置于PCR仪上65℃10min，立即冰浴5min。

然后加入以下试剂：

变性后的RNA溶液

5×

RTbuffer

4µ

dNTPmixture

2µ

RNaseInhibitor

ReverTraACE

20µ

按以下程序反转录：

1、42℃，45min

2、99℃,5min

将cDNA-20℃保存。

3、PCR反应体系及程序

ddH2O

7.5µ

cDNA

3µ

上游引物

下游引物

2×

Mastermix

12.5µ

25µ

反应程序：

1、94℃，3min

2、95℃，30sec

3、56℃，30sec×

35cycles

4、72℃，1min

5、72℃，10min

三、电泳

用TAE电泳缓冲液配制1.8%的琼脂糖凝胶，100ml加入5µ

l染色液。

80V/70Ma电泳40min观察结果，在阳性对照出现133bp条带、阴性对照无条带的情况下，检测样品如出现133bp的条带，判定为猪瘟病毒阳性。

猪繁殖与呼吸综合症RT-PCR检测程序

材料冻干PRRS弱毒疫苗、检测用病毒RNA提取试剂盒（天跟公司产品）。

方法将1瓶PRRS弱毒冻干疫苗用2ml生理盐水或PBS液稀释，用1mlRNAase-free管分装，每管200µ

取出冻存的病毒，解冻后用于RNA的提取。

样品采集病死或扑杀猪，取病死或扑杀猪，取血清、淋巴结（包括肺门和腹股沟淋巴结）、肺脏、脾脏、流产胎儿等病变明显部位与正常组织交替处组织（检测蓝耳病必须包括淋巴结和肺脏样本）；

组织样品处理称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mlPBS（pH7.2）继续研磨制成1:

1、材料RT试剂盒（日本东洋纺产品）、PCR试剂盒（天跟公司产品）。

5’-CAACGCCAGCAACGACAG-3’,18bp，TM为59.58。

5’-ACGGAACCATCAAGCACAAC-3’,20bp，TM为57.8。

扩增的目的片段为468bp。

三、电泳

用TAE电泳缓冲液配制1.2%的琼脂糖凝胶，100ml加入5µ

80V/70Ma电泳50min观察结果，在阳性对照出现468bp条带，阴性对照无条带出现的情况下，检测样品如出现468bp的条带，判定为PRRS病毒阳性。

高致病性猪繁殖与呼吸综合症RT-PCR检测程序

材料阳性对照病料为该病的活疫苗、检测用病毒RNA提取试剂盒（天跟公司产品）。

方法RNA提取按试剂盒说明进行，最后用50µ

样品采集病死或扑杀猪，取血清、淋巴结（包括肺门和腹股沟淋巴结）、肺脏、脾脏、流产胎儿等病变明显部位与正常组织交替处组织（检测蓝耳病必须包括淋巴结和肺脏样本）；

组织样品处理称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mlPBS继续研磨，匀浆后转至1.5ml灭菌离心管中，8000r/min离心5min，取上清液用于RNA的提取；

5’-TGATGGGCGACAATGTCC-3’,18bp，TM为55.56。

5’-CGCAGGCAAATCCAGAGG-3’,18bp，TM为61.11。

扩增的目的片段为230bp。

1、PCR反应体系及程序

3、52℃，30sec×

用TAE电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶，100ml加入5µ

80V/70Ma电泳40min观察结果，在阳性对照出现230bp条带，阴性对照无条带出现的情况下，检测样品如出现230bp的条带，判定为高致病性PRRS病毒阳性。

猪流行性乙型脑炎RT-PCR检测程序

材料阳性对照病料为该病的弱毒疫苗、检测用病毒RNA提取试剂盒（天跟公司产品）。

lRNase-free水溶解RNA，得到RNA溶液。

样品采集采集病死或扑杀的猪，取血液、腹股沟淋巴结、脑脊髓液、死产胎儿的脑组织、分泌物、脾、肿胀的睾丸等组织病变与健康部交界处组织；

组织样品处理称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5ml生理盐水继续研磨，匀浆后-20℃反复冻融3次，转至1.5ml灭菌离心管中，8000r/min离心2min，取上清液用于RNA的提取；

三、RT-PCR反应

5’-GCTTGTTGGACGGCAGAG-3’,18bp，TM为59.58。

R：

5’-AGCCACATGATTGAGCCTTC-3’,20bp，TM为57.8。

扩增的目的片段为238bp。

1、RT体系及反应程序：

弱毒疫苗