卵巢癌抗独特型疫苗6B11mGM动物体内诱导抗肿瘤免疫应Word格式文档下载.docx

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刘蓓（天津市中心妇产科医院实验室，天津300052）

关键词：

卵巢癌；

抗体；

抗独特型；

肿瘤疫苗；

动物；

实验

　　【摘要】目的　观察卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv与鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（murinegranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor，mGM-CSF）的融合蛋白（6B11mGM）在小鼠体内诱导抗肿瘤免疫反应情况，探讨此种融合蛋白作为卵巢癌疫苗的可能性及适当的免疫方法。

　方法　用融合蛋白6B11mGM免疫BALB／c小鼠，制备抗血清。

采用间接ELISA及免疫流式方法分析抗血清特征。

　结果　经ELISA检测，融合蛋白6B11mGM免疫小鼠后，可诱导机体产生AB3。

同时可刺激小鼠脾脏淋巴细胞CD4＋细胞明显升高，CD8＋细胞略有升高。

　结论　融合蛋白6B11mGM可诱导机体产生特异体液免疫和细胞免疫反应，为抗独特型卵巢癌疫苗用于临床奠定了基础。

　　【中图分类号】R737.31　【文献标识码】A　【文章编号】0529-1357（2000）增-101

STUDYOFTHEANTITUMORIMMUNERESPONSESINDUCEDinvivoBYANTI-IDIOTYPICVACCINEOFOVARIANCANCER（6B11mGM）

CUIHeng，FENGJie，CHANGXiao-hong，YEXue，LIYi，CAOShan-jin，FUTian-yun，YAOYu，QIANHe-nian

　　（GynecologicOncologyCenter,PekingUniversityPeople’Hospital,Beijing100044，China;

）

　　LIUBei

　　（LaboratoryofCentralObstetricandGynecologicHospital,Tianjin,300052,China）

　　【Abstrac】ObjectiveToobservewhetherantitumorimmuneresponsecanbeinducedinBALB/cmiceimmunizedwithafusionprotein（6B11mGM）ofanti-idiotypicsinglechainantibody（6B11scFv）andmurinegranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor（GM-CSF）insteadofovariancarcinomaantigen.MethodsBALB/cmicewereimmunizedrepeatedlywith6B11mGM.IndirectELISAtestandimmuneflowcytometerwereusedforanalyzingthecharacterizationofanti-idiotypicScFv（Ab3）.ResultsAb3couldbedetectedintheseraofimmunizedmicewith6B11mGMbyELISAtest.Moreover,itstimulatedCD4+TcellfromthespleenofBALB/cmicetoproliferateandCD8+Tcelltoproliferateslightly.Conclusion6B11mGMprobablyinducebothhumoralandcellularimmunityagainstovariancarcinomainvivo.Itillustratedastrongbasicforusingfusionprotein6B11mGMasanti-idiotypevaccinesagainstovariancarcinoma.

　　【Keywords】Ovariancarcinoma;

Antibody/anti-idioype;

Tumorvaccine;

Animal;

Laboratory　　本中心采用杂交瘤技术制备出的小鼠内影像型抗独特型抗体6B11，在动物实验已证明可代替卵巢癌相关抗原OC166-9，诱发特异性抗卵巢癌免疫反应［1］。

但是鼠抗独特型抗体，作为疫苗反复应用于人体可诱导人抗鼠抗体（humananti-mouseantibody,HAMA）的产生。

同时抗独特型抗体只模拟少数表位，免疫原性弱，应用时还需要佐剂。

为了降低抗独特型抗体的鼠源性及提高其免疫原性，我们对本中心制备的小鼠内影像型抗独特型抗体6B11进行系列改造，使之更适应临床应用。

首先已成功构建了6B11单链抗体（6B11ScFv）［2］，随后又构建了6B11ScFv／人GM-CSF融合蛋白（6B11GM），通过融合蛋白形式，增强了抗独特型抗体的免疫原性，并且体外实验证明可引起以CD4＋为主的抗原特异性的T细胞增殖［3］，但由于缺乏合适的动物模型，而人GM-CSF和鼠GM-CSF尽管同源性很高［4］，结构相似，但它只能与各自相应的受体结合，没有交叉反应，具有绝对的种属特异性，即不能在鼠体内进行融合蛋白作为疫苗的效果和机制的体内实验，限制了进一步基础与临床研究。

因此，构建与融合蛋白6B11GM特性相似，且能在动物体内进行实验的融合蛋白具有重要的意义。

本中心采用基因工程和蛋白质工程技术，在6B11ScFv／hGM-CSF融合蛋白的基础上，构建了卵巢癌抗独特型单链抗体6B11与鼠GM-CSF（6B11ScFv／mGM-CSF）融合蛋白（6B11mGM）［5］。

我们用融合蛋白6B11mGM免疫动物，观察其在动物体内诱导的特异性免疫应答情况，为融合蛋白6B11GM能早日用于临床卵巢癌主动免疫治疗奠定了基础。

　　材料和方法

　　1.主要材料与试剂

　　BALB／c小鼠：

雌性，6～8周，购自北京大学医学部实验动物中心。

辣根过氧化物酶标记羊抗鼠lgG，北京中山生物技术有限公司。

异硫氰酸荧光素标记大鼠抗小鼠CD4、CD8：

美国GIBCO公司。

重组鼠GM-CSF纯品（美国RandDSystem）。

福氏完全佐剂（CFA）和不完全佐剂（IFA）（美国Sigma公司）。

　　2．动物免疫计划

　　根据本中心以往免疫动物的经验，采用3次免疫方案，第1次为基础免疫，第2、3次为加强免疫。

BALB／c小鼠共分8组，每组6～12只，分别以6B11ScFv、6B11ScFv+鼠GM-CSF、鼠GM-CSF、融合蛋白6B11mGM、6B11ScFV＋佐剂、6B11mGM佐剂＋佐剂，免疫动物。

以OC166-9（Ag）免疫组为阳性对照，以注射等量PBS的正常鼠为阴性对照。

　　基础免疫：

各组均采用100μg不同抗原，皮下3点注射（尾根皮下及双后趾底），其中，佐剂组加等量福氏完全佐剂（CFA）。

于免疫后10、14d内眦取血，以间接法ELISA测血清中抗一抗独特型抗体（Ab3），计算3只小鼠的平均值。

第1次加强免疫：

将经基础免疫后的小鼠，于2周后进行第1次加强免疫，各组剂量为50μg，部位同基础免疫。

其中佐剂组加等量福氏不完全佐剂（IFA），于该次免疫后10、14d，检测Ab3，方法同前。

　　第2次加强免疫：

将经第1次加强免疫后的小鼠，于2周后进行第2次加强免疫，各组剂量为50μg，以水剂腹腔注射，分别于末次免疫后7、14、21、28d处死小鼠，取血、脾，以检测Ab3及小鼠脾细胞的T细胞表型变化。

　　3．标本制备方法

　　抗血清的制备：

各次免疫间期，采用内眦取血，每次每组取血3只小鼠，分离血清；

末次免疫后，每组每周处死3只小鼠取血，分离血清。

各组免疫小鼠血清分别保存于－20℃，正常鼠为阴性对照，OC166-9（Ag）免疫组为阳性对照。

　　鼠脾淋巴细胞悬液的制备：

处死小鼠后，立即取脾脏，置0.01mol／LpH7.4PBS中，在平皿中研碎，以7号针头抽吸1次，再经过两次41-2针头，离心，弃掉上清，加3ml三蒸水，溶红细胞30s，立即加入1.8％NaCl，混匀。

1200rpm，离心10min，弃掉上清0．01mol/LpH7.4PBS洗1～2次。

0.2％台盼蓝染色，活细胞计数法计数活细胞比例＞95％。

用0.01mol／LpH7.4PBS调整细胞数至所需浓度。

　　4．融合蛋白6B11mGM诱导特异性体液免疫反应-

　　Ab3抗血清特性鉴定

　　采用间接ELISA法检测：

包被卵巢癌抗原OC166-9（2μg／ml），100μl／孔，4℃过夜，PBS-T洗3遍，加含1％BSA的PBS100μl／孔，37℃温育1h，弃孔内液，PBS-T洗3遍后，加以1：

20稀释的不同组免疫鼠抗血清及阴性（PBS）、阳性对照（COC166-9），100μl／孔，37℃温育1h，PBS-T洗3遍后，加1：

1000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠lgG，37℃温育1h，PBS-T洗3遍，每次5min，OPD显色，1mol/LH2SO4终止显色反应，测A490值。

　　5．T细胞表型（CD4、CD8）分析

　　采用流仪细胞仪（美国BD公司FACSTAR）作T细胞表型分析，标本制备如下：

先在每管加入制备好的鼠脾细胞悬液50μl（1×

106细胞），然后加入50μl，FITC标记的大鼠抗小鼠CD4和CD8，摇匀，4℃孵育45min；

0．01mol／LpH7．4PBS洗1～2次，1500rpm，离心5min，弃上清；

细胞沉淀用80％冷乙醇固定，4℃放置，检测前用PBS洗1次，加300μlPBS吹打悬浮后上机测定。

结　果1．融合蛋白6B11mGM免疫BALB／c小鼠诱发的特异性体液免疫应答

　　Ab3特性鉴定：

基础免疫后10d与第1次加强免疫后10d，各组鼠血清分别与卵巢癌初始抗原OC166-9结合活性进行比较。

基础免疫后10d获得的各组鼠抗血清，用ELISA检测证明除阳性对照外，各组与卵巢癌初始抗原OC166-9均无明显结合。

第1次加强免疫后10d获得的抗血清，用ELISA检测证明，融合蛋白6B11mGM免疫组Ab3水平明显高于除阳性对照组以外的其他对照组Ab3水平（表1，图1）。

表1　不同免疫原免疫BALB/c鼠诱导产生Ab3水平

　　Table1　ThelevelsofAb3inducedbydifferentimmunogensinBALB/cmice

第1次加强免疫后10d

　　10daysafterfirstboosting

基础免疫后10d