丁酸钠诱导Raji细胞基因表达的变化Word文件下载.docx

丁酸钠诱导Raji细胞基因表达的变化Word文件下载.docx

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RestrictionDisplayPCR；

Sodiumbutyrate；

Apoptosis；

Geneexpression

　　0引言

　　Raji细胞是悬浮状态生长的，但我们前期研究发现Raji细胞在丁酸钠的处理下可由悬浮生长状态转变为贴壁生长状态，伴随有细胞凋亡现象的发生[1]。

我们研究小组拟通过RDPCR显示mRNA表达差异来揭示丁酸钠诱导Raji细胞凋亡时基因表达的变化，试图寻找造成细胞发生形态学变化的主要基因，探讨丁酸钠作用的可能机制。

　　1材料和方法

　　主要试剂丁酸钠（SB），溴化乙锭；

DNA回收试剂盒；

mRNA纯化试剂盒，限制性内切酶Sau3AI，DNA连接试剂盒，LATag酶，RNasin，T4DNA连接酶，dNTP，PMD18TVector，JM109细菌；

丙烯酰胺，N，N’–甲叉双丙烯酰胺，琼脂粉，琼脂糖，Tag酶，低熔点琼脂糖；

胰蛋白胨，酵母提取物（英国OXIOD公司）；

Tris饱和酚；

逆转录酶，TRIzol试剂，DEPC；

RPMI1640；

小牛血清；

100bpDNALadder；

氯仿，异丙醇。

　　细胞培养Raji细胞株（来源于中山大学肿瘤防治中心）以含10%小牛血清的RPMI1640培养液于5%CO2中培养。

　　细胞mRNA的提取将生长状况良好的Raji细胞接种在6孔培养板中，细胞浓度为×

106/ml，加入3mmol/L丁酸钠，37℃、5%CO2培养。

总RNA的提取按照Invitrogen公司提供的TRIzol试剂说明书进行操作。

最后加30μlDEPC处理水溶解总RNA。

参照mRNA纯化试剂盒说明书操作，从总RNA中纯化mRNA。

　　从mRNA反转录成为cDNA及双链cDNA末端平滑化逆转录按照Invitrogen公司的说明书进行逆转录，mRNA约2μg，dNTP/L，OligdT15μmol/L，65℃，5min，加MMLV200U和酶反应缓冲液，37℃延伸时间75min。

cDNA样品20μl，70℃，10min。

加入5μlT4DNAPolymerase，5μl10×

T4DNAPolymeraseBuffer，5μl%BSA，μl/LdNTP，μl灭菌水，轻柔混匀。

37℃反应5min。

加入25μlEDTA（pH）和25μl10%的SDS，轻柔混匀，停止反应。

加入100μl酚/氯仿溶液，振荡，混匀。

10000g离心1min，液相分离，将上层水相转移至另一微量离心管中。

加入1/10体积3mol/LNaAc、倍体积预冷的无水乙醇，混匀。

-20℃，静置30min。

4℃离心13000g×

10min，弃上清，75%乙醇洗沉淀1～2次，晾干。

　　的酶切cDNA溶于20μl水中，定量后，取大约2μg进行酶切反应。

16USau3AI，37℃进行酶切反应，时间不少于2h。

　　接头与cDNA酶切片段的连接采用PCR引物设计软件设计两条单链寡核苷酸片段来生成接头，sip：

5’pGATCCACACCAGCCAAACCCA3’，SIR:

5’GGTTTGGCTGGTGTG3’。

接头生成按如下进行：

SIP（500μg/mlinwater）20μl，SIR（380μg/mlinwater）20μl。

混合后，90℃，→80℃，→70℃，→60℃，→50℃，→40℃，→30℃，→20℃，→4℃保持。

分装后，贮藏于-20℃备用。

接头与cDNA酶切片段的连接参照TaKaRaDNA连接试剂盒说明及所提供的试剂，步骤cDNA酶切反应液5μl，接头5μl，SolutionII10μl，SolutionI20μl。

混合均匀后，于16℃连接，时间不少于1h。

　　PCR反应用引物设计软件设计与SIR/SIP接头配套的通用引物U，其序列为GGTTTGGCTGGTGTG。

设计的限制性引物是在通用引物的GATC3’端分别加上一个碱基A、T、C、G，以下简称为引物A、T、C、G，引物序列如表1。

　　表1RDPCR的限制性引物

　　将引物A、T、C、G两两组合，共有10组，以接头与cDNA酶切片段的连接产物为模板，进行限制性分组PCR反应，反应条件①97℃2min；

②95℃30s，65℃30s，72℃1min，共35个循环；

③72℃5min；

④4℃保持。

扩增产物在8%的聚丙烯酰胺凝胶中平行电泳。

经EB染色后，在紫外灯下观察实验组与对照组的基因表达差异，参照DNA回收试剂盒说明书回收差异条带。

　　纯化后PCR产物与载体连接转化测序将纯化的PCR产物与pMD18TVector连接，操作按说明书进行：

pMD18TVectorμl，PCR产物μl，SolutionIμl，16℃连接3h。

转化JM109感受态细菌。

阳性克隆的挑取、鉴定及扩大培养。

目的基因片段由上海博雅公司测序。

　　生物信息学分析差异片段测序后在因特网上登录NCBI的网址，通过AdvanceBLAST程序进行同源性分析。

在GeneBank中搜索是否有和所发现的片段同源的基因，同源性比较见实验结果部分。

　　2结果

　　PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图，EB染色用引物A、T、C、G两两组合，共有10种组合，分别为AA、AT、AC、AG、TT、TC、TG、CC、CG、GG10组。

对从对照组和实验组的细胞中获得的cDNA进行限制性分组PCR，扩增产物平行地在聚丙烯酰胺凝胶上电泳，经EB染色后，如图1。

聚丙烯酰胺凝胶电泳，偶数泳道为对照组，奇数泳道为实验组，可明显看出平行的两组基因表达方面的差异。

　　差异片段的测序与生物信息分析结果差异片段的测序在上海博雅公司进行。

测序生物信息分析结果，见表2。

　　1：

标准分子量；

2：

AA组；

3：

4：

AT组；

5：

6：

AC组；

7：

8：

AG组；

9：

10：

TT组；

11：

12：

TC组；

13：

14：

TG组；

15：

16：

CC组；

17：

18：

CG组；

19：

20：

GG组；

21：

GG组

　　图1RDPCR电泳图

　　3讨论

　　RDPCR技术的思路是在获得反转录的cDNA之后，进行Sau3AI酶切。

Sau3AI识别位点是四个碱基，理论上计算平均每256个碱基有一个识别位点。

在酶切片段的两端加上由15bp和21bp长的两条互补寡核苷酸单链逐步退火形成的通用接头，接头的一端为4个碱基的粘性端GATC，恰好与选用的Sau3AI的酶切位点互补，另一端为2个碱基的粘性端CA，可以减少片段自身间的串联。

酶切片段加上接头之后，用与接头序列配套的限制性引物进行扩增（见表1）。

将各引物两两组合，共10组，以接头与cDNA酶切片段的连接物为模板，进行限制性分组PCR反应，各组产物在电泳和染色后，容易观察基因差异表达。

　　表2差异表达序列的分析结果

　　现已知丁酸钠可以通过抑制去乙酰化酶改变染色质的构象，导致基因转录的改变。

我们研究小组利用RDPCR来揭示丁酸钠诱导Raji细胞凋亡时基因表达的变化，探讨丁酸钠作用的可能机制。

现对获得的差异片断分析讨论。

对照组细胞高表达的基因有6条。

gi|4504150|ref|NM_|是人granulin（GRN）片断。

Progranulin和它的水解产物granulin也称畸胎瘤细胞源性生长因子（PCcellderivedgrowthfactor，PCDGF）或epithelin，可刺激细胞增殖，使细胞锚着非依赖性生长。

研究表明PCDGF作为一种自分泌生长因子与多种肿瘤，例如乳腺癌、肾上腺癌、神经胶质瘤等的发生、侵袭及细胞存活密切相关[3,4]。

gi|5817109|emb||HSM800843来源于人DKFZp566D143克隆cDNA，尚未见文献报道其功能。

gi|3882182|dbj||来源于人KIAA0731蛋白编码序列。

有文献报道KIAA0731蛋白在滤泡状甲状腺瘤中表达上调。

gi|33466037|gb||来源于人线粒体基因序列。

尚未见文献报道其功能。

gi|188427|gb||HUMMHDRS02来源于人HLADRalphachain（chainp34）基因外显子2、3、4和5。

文献报道Raji细胞表面HLADR抗原表达率为%。

gi|15431298|ref|NM_|来源于人核糖体蛋白L18（RPL18）的mRNA序列，全长648bp。

有研究发现，核糖体蛋白L18的mRNA在人类结肠癌组织的表达比普通的结肠组织高。

实验组高表达的基因序列8条：

gi|33466037|gb||和gi|13272612|gb||来源于人线粒体基因序列，尚未见文献报道其功能。

gi|17065925|emb||HSDJ622L5与人染色体同源，未见文献报道其功能。

gi|37046837|gb||来源于人核糖体蛋白L23a的mRNA序列。

全长985bp，未见文献报道其功能。

gi|34784771|