免疫荧光染色方法.docx

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免疫荧光染色方法

免疫荧光染色方法

（一）制片

选无自发性荧光的石英玻片或普通优质玻片，洗净后浸泡于无水乙醇和乙醚等量混合液中。

用时取出用绸布擦净。

将待检样品如组织块剪成适当大小印压于玻片上。

也可采用冰冻切片或石蜡切片样品。

（二）固定

除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。

固定的作用有三：

①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原—抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存，如组织切片固定后在-20℃下可保存一年而不改变其染色特性。

标本的固定原则是：

①不能损伤细胞内的抗原；②不能凝集蛋白质；③不能损伤细胞形态；④固定后应保持细胞膜的通透性，以允许抗体进入与抗原结合。

常用抗原物质的固定方法

抗原物质         

固定剂

固定条件（min）

蛋白质抗原

95%～100%乙醇

室温3～10

酶、激素

丙  酮

4℃  30

免疫球蛋白

四氯化碳

病    毒

丙酮、四氯化碳、无水乙醇

室温5～10或4℃ 30～60    

多糖、细菌等  

微火加热，甲醇、10%甲醛、丙酮

室温5～10或4℃30～60

类    脂     （异嗜性抗原）

10%甲醛，10%佛茂尔（ForMol）

室温3～10

（三）水洗

固定后以冷的0.01Mol/LpH7.4PBS液浸泡冲洗，最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。

（四）染色

染色分直接染色法与间接染色法。

1．材料与试剂

（1）荧光抗体，稀释至应用浓度。

（2）0.01Mol/LpH7.4PBS液

（3）9份优质甘油加1份pH7.4PBS液即为甘油缓冲液。

甘油有减少非特异性荧光的作用。

（4）带盖方盘

2．直接染色法

（1）将固定好的玻片置于湿盘中，滴加荧光抗体染色液，以覆盖为度，加盖，37℃感做30min～45min。

（2）PBS冲洗3次，每次冲洗3min，即3×3ˊ冲洗。

（3）蒸馏水冲洗。

（4）滴甘油缓冲液一滴，封片，荧光显微镜检查。

2．间接染色法

（1）检查抗原：

①取固定标本，加已知的免疫血清，37℃孵育30min；②以PBS液3×3ˊ冲洗；③再加荧光标记的抗抗体，37℃孵育30min；④PBS3×3ˊ冲洗；⑤H2O冲洗，凉干；⑥加甘油缓冲液，封片、镜检。

（2）检查抗体：

①以免疫后动物的淋巴组织涂片，自然干燥，甲醇固定；②滴加相应抗原液（按1﹕100～1﹕500稀释），37℃孵育30min；③PBS液3×3ˊ冲洗；④加荧光抗体，37℃孵育30min；⑤PBS液3×3ˊ冲洗；⑥水洗，凉干；⑦加甘油缓冲液，封片、镜检。

（五）结果显示

荧光显微镜所观察到的图象，主要以两个指标判断结果，一个是形态学特征；另一个是荧光的亮度，在结果的判定中，必须将二者结合起来，综合判定。

荧光强度的表示方法如下：

＋＋＋～＋＋＋＋：

荧光闪亮，呈明显的亮绿色。

＋＋：

荧光明亮，呈黄绿色。

＋：

荧光较弱，但清楚可见。

±：

极弱的可疑荧光。

－：

无荧光。

（六）标本保存

由于荧光色素和蛋白质分子的稳定性都是相对的，因此随着保存时间的延长，在各种条件影响下，标记蛋白可能变性解离，失去其应有的亮度和特异性。

因此给标本的保存带来一定的困难，所以在标本进行荧光染色之后应立即观察。

保存的方法可采取以下几种：

①固定标本片以后低温保存，随用随染；②染色片采取优质封固剂，如特别的荧光封固剂（Fluormount）或碱性优质纯甘油固剂等封固。

这些封固剂能防止荧光激发，封固后低温保存；④可以采用拍照保存照片。

荧光原位杂交（FISH）实验步骤

仪器设备

    1、医用微波炉；

    2、水浴锅；

    3、OLYMPUSBX51荧光显微镜；

     4、OLYMPUSDP11数字显微照相机。

FISH试剂

（1）1×PBS：

由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃；

（2）20×SSC（pH7.0）；

     （3）2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成；

     （4）25mg/ml蛋白酶K消化液。

     （5）变性液（70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0）：

4ml20×SSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺。

每次新鲜配制。

     （6）杂交后洗涤液：

20×SSC4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。

每次新鲜配制。

调节pH前升至室温。

实验步骤

    1、脱蜡：

     1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；

     2）100％酒精两次，每次2min；

     3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。

    2、蛋白酶处理:

     1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：

2×SSC40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。

将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。

     2）37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。

37℃孵育20min。

     3）×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。

     4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。

    3、变性：

     1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；

     2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；

     3）78℃孵育8min；

     4）即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min；

     5）空气干燥。

    4、杂交：

     1）准备探针；

     2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；

     3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；

     4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。

     杂交后的水洗：

     5）镊子小心去除盖玻片；

     6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；

     7）2×SSC（37℃）洗两次，每次10min；

     8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。

     检测：

     9）从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。

把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。

     10）每张切片使用30μl～60μl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min；

     11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。

1×PBS室温下洗3次，每次2min。

扩增：

     12）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；

     13）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；

     14）去掉塑料盖膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。

1×PBS室温下洗3次，每次2min；

     15）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；

     16）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；

     17）1×PBS室温下洗3次，每次2min。

    5、细胞核染色：

     1）张切片加10μl～20μlDAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2～5ml；

     2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。

切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。

PRINS步骤

    1、常规脱蜡浸入0.01mol/LPBS；

    2、用0.2mol/L盐酸处理5min；

    3、蛋白酶K（25μg/m1）消化37℃15min；

    4、分别用80％，95％和100％酒精脱水，室温干片；

    5、加PCR混合液25μL（10mmol/LTris-HCl，50mmol/LKCl，1.5mmol/LMgCl2，各加200μmol/LdATP，dCTP，dGTP，1.5mmol/Ldig-11-dUTPl.5μl，引物250ng，TaqDNA聚合酶2U），加盖片；

    6、94℃变性5min后置入65℃湿盒中5min；

    7、用0.1×SSC液，65℃洗5min；

    8、片于65℃10s～20s；用4×SSC-0.1％吐温20液42℃洗5min，2次；

    9、经BufferI液洗后滴加20％羊血清封闭30min；

    10、加地高辛抗体复合物（1:

500）室温下2h；

    11、BufferⅢ液洗5min；

    12、用BCIP-NBT显色1h～2h，在镜下控制，终止显色；

    13、用中性红或核固红衬染，酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片。

FISH-荧光原位杂交实验（原位杂交）

1.实验目的

通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在生物学、医学领域的应用。

掌握原位杂交技术的操作方法，熟练掌握荧光显微镜的使用方法。

2.实验原理

荧光原位杂交（FluorescenceinsituhybridizationFISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。

目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。

FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。

由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。

与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。

杂交所用的探针大致可以分为三类：

1）染色体特异重复序列探针，例如a卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。

探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。

间接标记是采用生物系标记的dUTP（biotin-dUTP）经过缺口平移法进行标记，杂交之后用藕联的荧光素的抗生物系的抗体进行检测，同时还可以利用几轮抗生物素蛋白—荧光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素蛋白—荧光素的处理，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。

而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸蔌磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。

直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。

3.实验用具及材料

Y染色体探针、人外周血中期染色体细胞标本、恒温水浴锅、培养箱、染色缸、载玻片、NikonE-400、荧光显微镜、盖玻片、封口膜、200mL移液器、20mL移液器、暗盒、指甲油、甲酰胺、氯化钠、柠檬酸钠、氢氧化钠、吐温20。

4.实验方法及步骤

1）探针及标本的变性

（1）探针变性

将探针在75℃怛温水浴中温育5min，立即置0℃，5～10min，使双链DNA探针变性。

（2）标本变性

①将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3h。

（经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片）。

②取出玻片标本，将