生化分析仪的基础与应用全解Word格式文档下载.docx

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C——溶液的浓度；

L——光程，即溶液的厚度。

可见、收光谱法的定量基础是朗伯比尔（Lambert-Beer）定律：

A=lgIo/It=-lgT=lg1/T

吸光系数即当一束强度为L的平行单色光通过一个含有浓度为C的吸光物质、厚度为L的吸收他时，光的一部分被吸收，光强度从IO减小至It。

当吸光系数k一定时，透过光与浓度或厚度呈指数函数关系，但吸光度（absorbance，A）与浓度或厚度呈简单的正比关系。

在浓度、厚度、单色光波长、溶剂及其温度等相同条件下，不同吸光物质的吸光度不同，即它们的吸光系数（absorptivity）不同。

是物质的特性常数，它只和该物质分子在基态和激发态之间的跃迁几率有关。

它的物理意义是吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸光度，常用的表示方式是摩尔吸光系数（molarabsorptivity）。

摩尔吸光系数即1摩尔浓度的溶液在厚度为1cm时的吸光度。

在吸光度与浓度之间的直线关系中，吸光系数是斜率，其值愈大，测定灵敏度愈高。

应用注意点：

1．由于物质对不同波长的光有不同的吸光系数，Beer定律成立的重要前提之一是单色光，即只有一种波长的光。

但在实际测定中，入射光常常并非严格的单色光，常有不同波长的辐射同时存在。

此种多色辐射是使测定中吸光度的变化偏离Beer定律（常为负偏离）的主要光学影响因素。

单色光的纯度可用谱带宽度（bandwidth）衡量。

单色光源是用分光光度计由单色器或滤光片从连续光谱的多色光中选择的、最大吸收波长λmax在内的一小段波长范围的复合光。

以谱带宽度较小、吸收峰较宽的λmax作为测定条件。

2．Beer定律一般适用于稀溶液的测定有两层含义：

被测物的浓度不宜过大，其吸光度应在相对测量误差较小的区域；

溶液在反应中存在化学平衡，受浓度、pH、溶剂和温度等因素的影响。

3．介质不均匀引起偏离当待测试液是胶体溶液、乳浊液或悬浮液时，入射光因一部分散射损失，使透光率减小，实测吸光度增加。

比浊法及免疫浊度反应的特点

比浊法与可见、紫外吸收光谱法不同，它们不是测定澄清溶液而是测定悬浮液或胶体溶液中物质的浓度，分析的光学基础是分散颗粒对光的反射、折射、散射和吸收等多种作用。

生化分析仪通过免疫比浊法等技术，架起临床生化与现代免疫技术的桥梁，免疫化学法的应用日益广泛。

1．比浊法的分类及原理在光源的光路方向上测量透射光（实际包括透射光和散射光）强度与入射光强度的比值和被检溶液中颗粒浓度间的关系，称为透射比浊法（turbidimetry）。

在光路的一定角度（一般为5o－90o）方向上测量散射光强度和被检溶液中颗粒浓度间的关系，称为散射比浊法（nephelometry）。

透射比浊法的计算公式是：

In（IO／I）＝　τb

令τ=2．3kc

lgIo/I＝kbc

即当一束强度为Io的平行光通过一个散射颗粒浓度为c混浊介质厚度为b的稀的悬浮液后，人射光被吸收和散射，光强度衰减至I，在浊度系数为τ时，透过率与颗粒浓度呈线性关系。

散射光强度与悬浮液或胶体溶液中的颗粒质点大小、入射光波长大小及二者的比例有关。

颗粒直径接近或大于光源波长时，常呈透射光和光路上的向前散射光，其散射光强度与入射光强度的关系遵从Mie散射理论，光散射随波长的变化小。

颗粒远小于光源波长（d小于0．05λ）时常呈偏离光路方向、900对称分布的散射光，其散射光强度与人射光强度的关系符合Rayleigh散射定律，波长愈短，散射光愈强。

一般比浊法的灵敏度不如可见、紫外吸收光谱法，但免疫浊度法的敏感度约为50ng／rnl。

聚合剂（如聚乙二醇6000－10000）可提高免疫复合物的形成速度。

胶乳增强免疫浊度法（latexenhancedturhidimetricimmunoassay）由于采用颗粒较大、折光性强的胶乳，将抗体经吸附或共价交联反应固定于胶乳表面，增加抗原抗体凝聚体积，减少透过光，使灵敏度提高到近1ng／ml水平。

散射比浊法的灵敏度比透射比浊法高，但干扰因素较多。

比浊法的精密度相近，变异系数为1％－5．5％。

目前，由于技术发展，两种比浊法的灵敏度和特异性已接近，而全自动生化仪的自动化程度和精密度要胜于专用散射比浊仪，故透射免疫比浊法在临床上的应用日益广泛。

速率法的灵敏度和特异性都优于终点法，但终点法的稳定性较好。

2．免疫浊度反应的特点

抗原抗体反应与其他化学反应不同，在免疫浊度反应中，抗原抗体复合物的生成量和生成颗粒的大小，与反应体系中抗原抗体的比例关系极大抗原相对不足时，生成的免疫复合物沉淀量少；

抗原抗体比例合适时，复合物生成量达到峰值；

抗原过量时，复合物反而再溶解，沉淀量下降。

临床上免疫比浊法多用抗体测定抗原，保证抗体足量、

防止抗原过量是基本的方法学条件。

要使在临床常见的高抗原浓度范围内（至少高于正常参考上限50％）抗体也足以与之反应，只有这样，抗原抗体复合物的生成量才随抗原的增加而递增，光散射的强度才与抗原量成比例。

抗体不足时，测定结果往往偏低。

3．应用注意点

（l）若悬浮颗粒本身具有特征吸收，则吸收作用是主要的，宜选择最大吸收波长作比浊测定；

若悬浮颗粒本身无特征吸收而介质对人射光有吸收，则测定必须选择在高透光度的波长区。

若悬浮颗粒小（粒径小于35nm），溶液浊度小，透射比大于90%，不宜选用透射比浊法，应选择散射比浊法测定。

（2）透射比浊时，35－100nm大小的微粒在波长290－410nrn下有最大吸收峰，免疫复合物的大小大致在此范围。

散射比浊时，较大的散射光角度适用于35－100nrn大小的微粒，较小的散射光角度适用于100－800nrn间的微粒。

血浆中的白蛋白、β脂蛋白、免疫球蛋白等微粒直径多在50nrn以下，其散射光是对称的。

IgM、乳糜颗粒、免疫反应初期产生的抗原抗体复合物等颗粒的直径在50-400nrn，都属颗粒直径接近或大于光源波长这一类，其散射光是不对称的。

（3）非特异性光散射的影响：

免疫浊度法常受内源性光散射的干扰。

血清中的乳糜微粒、VLDL、LDL以及反应体系中的颗粒都会产生杂散光，影响比浊灵敏度。

为避免上述影响，样品组分的比例，透射比浊法宜在3％以下，散射比浊法应在0．5％以下。

所用的试剂要澄清，必要时经0．22μm滤膜过滤。

应作试剂空白和样品空白。

（4）带现象（zonephenomenon）的影响：

抗原或抗体过剩使免疫复合物部分或全部解离的现象，称为带现象。

免疫浊度测定中常表现为抗原过剩时免疫复合物形成的量反而下降，又称钩状效应（hookeffect）。

克服办法主要是：

采用高质量试剂，设置仪器监测，减少血清用量。

（5）伪浊度的影响：

即不是特异性抗原抗体反应产生的免疫复合物形成的浊度。

形成原因复杂，主要是抗血清存在的非特异性交叉反应性杂抗体成分，增浊剂浓度过高和反应时间掌握不当，样品本身的浊度处理不当，试剂污染和变质，比色杯不洁，等等。

（6）校准与计算：

应选用适当的校准品及浓度作剂量反应曲线。

曲线往往有截距或呈S形，不成直线。

自动生化分析仪多推荐5点或6点定标，然后选择适当的数学模型作曲线拟合，如Ingit－Log变换或y＝d＋cx＋bx2＋ax3的3次方程回归曲线。

更换试剂批号时也必须重新校准曲线。

（三）均相酶免疫分析

酶联免疫分析利用免疫反应的高度特异性和酶促反应的高度敏感性对抗原或抗体进行测定，均相酶免疫分析（homogeneousenzymeimmunoassay）是其中的一类。

在均相酶免疫分析中，最常用的是酶放大免疫分析（enzymemultipliedimmunoassay，EMIT）。

其原理是：

当酶标抗原（半抗原）与相应抗体结合，生成酶标抗原抗体复合物后，对标记酶产生调节作用，使酶的构象改变，酶活性抑制、恢复或增强，酶催化的信号随之发生改变；

酶标抗原抗体复合物与游离酶标抗原同处一相，不需分离步骤就可测定酶活性，计算出被检抗原（半抗原）的含量。

常采用酶标抗原与未知抗原对特异性抗体的竞争反应：

抗原与标记酶结合使酶的活性抑制或激活，再与相应抗体结合后其酶活性被激活或抑制，未知抗原和酶标抗原与抗体形成竞争体系。

均相酶免疫分析目前主要用于检测小分子半抗原，如某些激素、药物或代谢产物，也逐渐用于大分子物质，如血清IgG测定。

测定药物的灵敏度一般为0．5－2μg／ml。

方法简便、快速，准确性和重复性好，但影响酶活性的因素也必然影响酶联免疫分析。

克隆酶供体免疫分析（clonedenzy。

donorimmunoassay，CEDIA）是有发展前途的均相酶免疫技术，灵敏度比一般酶免疫法高。

其原理为：

用基因工程技术制备称为酶供体（ED）和酶受体（EA）的两肽段。

ED和EA独立存在时无酶活性，但在合适条件下可以自动装配并聚合成具有酶活性的四聚体。

ED标记申抗原小分子或抗原大分子后，不影响其与EA的装配，但当相应抗体存在时，抗原抗体结合后形成的空间位阻使酶的装配受阻，使用竞争结合模式即可检测末知的半抗原或抗原。

（四）酶促反应的特点：

由酶催化的反应称为酶促反应。

以酶作为试剂来进行分析测定，或通过酶促反应测定待测酶的活性，具有高效、专一、温和、灵敏的特点，广泛用于生化分析。

试剂中的酶活性（浓度）在反应过程中始终不变。

下面仅对酶活性测定知识作介绍。

1．酶活性测定生物体内含有成千种酶，存在于细胞中。

当细胞通透性增加或细胞破裂时，会使体液中酶浓度增加，因此测定体液中特别是血液中酶浓度的变化有助于临床诊断疾病、判断预后和观察疗效。

血液中的酶含量甚微，一般每毫升含量在微微克（Pg）到毫微克（ng）水平，因此要直接测定酶含量是非常困难的。

虽然近年免疫学技术发展迅速，可以对某些酶直接进行测定，但目前临床仍以测定酶活性间接推算酶的含量。

酶活性的大小，是在一定条件下通过测定酶促反应过程中单位时间内底物的减少量或产物的生成量引起的吸光度变化，即测定酶促反应的速率来获得的。

一般情况下，产物和底物的浓度变化是一致的，但测定产物的生成要比测定底物的减少为好。

这是由于反应体系中使用的底物往往是过量的，反应时间通常又很短，尤其在酶活性很低时，底物减少量仅占加入量的很小比例，因此测定不易精确；

反之，产物从无到有，只要测定方法灵敏，准确度可以很高。

所以，酶活性测定大多数采用测定产物生成速率的方法。

2．酶促反应三阶段酶促反应是一个可逆反应，其反应全过程的速率并不都与酶活性成正比。

将酶促反应过程中测得的产物或底物的变化量对时间作图，得到酶促反应时间进程曲线，

图中产物P或底物S的浓度变化曲线的斜率就代表酶反应速率。

酶促反应一般分为三阶段。

（1）延滞期（lagphase）：

底物与酶混合、反应启动后的一段短时间内，产物从零开始逐渐生成，处于较低水平，反应速度较低，未达到待测酶最大反应速度；

另外，在酶偶联反应中，指示酶的反应必须有一定量测定酶的产物堆积才能进行；

这些都使酶反应要稍待一定时期后，吸光度才有明显的线性变化，这一时期称为延滞期。

延滞