qpcr步骤Word格式.docx

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扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数。

实验材料及方法

1实验试剂和耗材

1.1试剂

表1-1实验所需试剂

试剂名称

货号

生产厂家

10×

Buffer

DDR006B

TAKARA

dNTP（2.5mM）

EXHSTaq

TaqManPEProbe

上海生工

PEQ-PCRPrimer1.1

IndexQ-PCRPrimerRR

SEQ-PCRPrimer1.1

SEQ-PCRPrimer2.1

ROX

12223－012

Invitrogen

含ThermoPol缓冲液MgSO4（100mM）

B9004S

NEB

Tween20

P9416-100ML

SIGMA

DMSO

DT0163-500ML

Betaine

B2629-1KG

SRNAPCRPrimer1

SRNAPCRPrimer2

1.2耗材

表1-2实验所需耗材

耗材

型号

96孔国产光学反应板

国产

光学封口膜（泛特津）

0.2mlSterile,PCRmicrotubes

PCR-02D-C

Axygen

0.6ml离心管

MCT-060-C

吸嘴0.5-10ul超微量、袋装

T-300

吸嘴200ul黄色吸嘴、袋装

T-200-Y

吸嘴1000ul蓝色、袋装

T-1000-Y

1.5ml离心管

MCT-150-C

2实验仪器设备

表2-1实验所需仪器设备

设备

StepOnePlus™Real-TimePCRSystem

4376592

ABI

迷你离心机

LX-200

海门其林贝尔

Vortex

QL－901

微孔板离心机

MPS-1000

Labnet

3实验操作流程

3.1填写Q-PCR实验登记表

样品的交接按照《质控组样品交接管理规程》执行。

实验前，先在“表单准备区”将要检测的样品在《Q-PCR实验登记表》中填写好，并根据“文库交接检测”文件夹中《____组文库检测结果》中的待测样品的顺序按顺序填到《Q-PCR实验登记表》上，并在右上角注明批次后打印出来。

然后将需要检测的样品的样品名和文库号按照《Q-PCR实验登记表》上的顺序粘贴到“文库核对&

存放位置”文件夹中的《文库检测前核对表》Excel表中，等待核对样品信息。

3.2稀释标准品

开始实验前，到-20℃冰箱和冰柜中将实验所需的标准品和样品取出，并按Q-PCR实验登记表上的顺序排好，并到表单准备区，用扫描枪将样品的文库号扫描到“文库核对&

存放位置”文件夹中的《文库检测前核对表》Excel表中进行核对，核对结果为“错错错错”，则样品不正确需重新找取样品信息相同的样品；

核对结果为“对”，则样品正确。

核对完样品信息后，将样品和标准品拿到“稀释区”进行稀释。

名称

移液量

超纯水（μl）

终浓度（pM）

Std1

原管（1nM）

不稀释

1000

Std2

2μl（Std1）

18

100

Std3

2μl（Std2）

10

Std4

2μl（Std3）

1

Std5

2μl（Std4）

0.1

1）取5个0.2mlPCR离心管，分别标记为Std1、Std2、Std3、Std4和Std5。

标准品多于一种时应标明标准品的名称。

2）分别吸取18μl超纯水至Std2、Std3、Std4和Std5离心管。

3）使用新Tip移取2μlStd1至装有18μl超纯水的Std2离心管，用Vortex振荡10至15秒，用力用手甩离心管，将壁上的液体甩下。

4）使用新Tip移取2μlStd2至装有18μl超纯水的Std3离心管，用Vortex振荡10至15秒，用力用手甩离心管，将壁上的液体甩下。

5）使用新Tip移取2μlStd3至装有18μl超纯水的Std4离心管，用Vortex振荡10至15秒，用力用手甩离心管，将壁上的液体甩下。

6）使用新Tip移取2μlStd4至装有18μl超纯水的Std5离心管，用Vortex振荡10至15秒，用力用手甩离心管，将壁上的液体甩下。

7）将已稀释的标准品置于4℃或冰上。

【注意】

●原管（1nM）的标准品要用时从-20℃冰箱中的标准品盒子中取出；

不用时应及时放回-20℃冰箱中，以防降解。

●实验前带上口罩和新手套，并用70%酒精将实验台擦拭一遍。

●移液要准确，振荡要充分，振荡前需检查管盖是否盖严。

●使用超纯水稀释标准品。

3.3稀释样品

1）如果待测文库是需要混合的Index文库，则先按照《Q-PCRpooling规则》混合好，贴好标签等待检测。

2）取和待测样品数量相同的0.6mlPCR离心管，分别标记为待测样品名称或者是样品管盖上的记号。

3）如果待测样品体积小于15ul（如表达谱、SmallRNA组的样品），则分别吸取99μl超纯水至每个离心管中；

如果待测样品体积大于15ul，则分别吸取198μl超纯水至每个离心管中。

4）将待测文库的样品原管充分振荡，短暂离心后，按照Q-PCR实验登记表上的顺序排好，然后分别移取样品溶液至相对应的装有超纯水的离心管中，如果样品体积小于15ul的，则吸取1ul的样品到装有99ul超纯水的离心管中；

如果样品体积大于15ul，则吸取2ul样品到装有198ul超纯水的离心管中。

振荡10至15秒，短暂离心。

5）将已稀释的样品置于4℃或冰上；

将样品原管放回-20℃冰柜中的编号盒存放，将样品放到编号盒中腾空的位置，并将样品的文库号用扫描枪录入“文库核对&

存放位置”文件夹中的《上机文库存放位置表》Excel表中的对应位置存档。

●移液要准确，振荡要充分，振荡前需检查管盖是否盖严，吸取样品后确保管盖盖严。

●使用的超纯水稀释样品。

3.4配制反应预混液

1）到隔壁实验室的“Mix配制区”配制反应预混液。

取1.5ml或2ml离心管，在管盖上标记上Mix，套上锡箔纸。

2）按以下反应体系准备反应预混液（以8个PE样品、1条标准曲线和10个SE样品、2条标准曲线为例）：

表3-4-1PEMix的配置

组分

1次反应所需用量（μl）

37次反应所需用量（μl）

PEMix

7.05

260.85

0.8

29.6

Probe

0.25

9.25

0.2

7.4

PEPCRPrimer1.1

0.3

11.1

IndexPCRPrimerRR

EXTaqHS

3.7

Template

——

Total

9

333

*标准品5个浓度各2个反应孔，NTC（无模板对照）1个反应孔，每个样品3个反应孔，2孔用于移液损失，共37孔。

表3-4-2SEMix的配置

53次反应所需用量（μl）

SEMix

7

371

42.4

EvaGreen

0.5

26.5

10.6

SEPCRPrimer1.1

SEPCRPrimer2.1

5.3

477

*2条标准曲线，标准品5个浓度各2个反应孔，NTC（无模板对照）1个反应孔，每个样品3个反应孔，2孔用于移液损失，共53孔。

其中，PEMix和SEMix的组分和每孔反应所需的用量如下表：

表3-4-3PEMix表3-4-4SEMix

所需用量（μl）

MgSO4

Tween20100×

H2O

3.35

3.3

2

3）上下颠倒离心管混匀或振荡10至15秒，短暂离心。

4）将反应预混液置于4℃或冰上。

●配制反应预混液必须到“Mix配制区”进行，避免扩增子污染。

●移取PEMix或SEMix前，摇晃离心管以彻底混匀。

●使用超纯水配制反应预混液。

●Mix配制区的所有物料，仪器，工具都严禁带到其他区域。

3.5加样

1）Mix配制好之后，将Mix放在传递窗中，回到稀释样品的实验室，将Mix从传递窗中取出，并在“点样区”进行加样。

2）取出96孔国产光学反应板置于基座上。

3）将预先配好地反应预混液加到各反应管孔中，每孔加入9μl反应预混液。

然后按照由A到H、由1到12的顺序向反应孔中加入1μl已稀释的标准品、样品和阴性对照，向标准品反应孔中加入1μl梯度稀释的标准品，每个梯度重复两次；

向样品反应孔中加入1μl已稀释的样品，每个样品重复三次；

向无模板对照（NTC）反应孔中加入1μl已灭菌超纯水。

4）使用ABI公司配备的封膜工具和光学封口膜（泛特津）封闭反应板。

5）封好膜之后，到荧光定量PCR仪放置的实验室，使用Labnet的MPS-1000微孔板离心机离心反应板，离心时间为4min。

离心前注意配平。

板子放置时，底部朝外。

6）将反应板装载到StepOnePlus扩增仪以准备运行。

3.6设置反应程序

3.6.1双击桌面StepOnesoftwarev2.0软件快捷键。

3.6.2如果有设置好的程序模板，则点击菜单栏的“Open”在“桌面/Q-PCRResults/Q-PCRTemplates”里找到和《Q-PCR实验登记表》上名字相同的程序模板，在ExperimentNam