50L发酵罐的使用实验报告Word文档下载推荐.docx

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认识发酵罐培养基的灭菌，认识反应器在位高压灭菌的方法和规程，学会反应器培养液灭菌过程中的升温、保压、降温和培养温度的设定等操作；

掌握接种的方法及操作，确保发酵液无杂菌污染；

掌握pH调节剂、消泡剂及补料的连接方法；

学会从反应器中定时取出样液的方法；

学会如何进行参数控制并掌握正确使用先进反应器发酵生产的方法，从而可对中试级中试以上的发酵生产研究有一个初步的概念和感性认识。

二、实验原理

1.安装和拆卸

反应器为碟形，上盖可以自动起降，与罐体通过橡皮垫圈和螺栓密封。

盖上设有搅拌电机、搅拌轴、机械密封及多个接口（接种口、空气进口、尾气出口、各种检测仪表的插孔、消泡剂和

加电压固定在电流电压图中的平坦部分，电极输出电流就可以校正测量溶解氧，这个固定电压常选为0.6~0.8V。

反应式为：

阴极：

O2+2H20+2e-→H2O+2OH-

H2O2+2e-→2OH-

阳极：

Ag+Cl-→AgCl+e-

总反应：

4Ag+O2+2H2O+4Cl-→4AgCl+4OH-

用NaCl或KCl作为电解质，在使用过程中电解质被消耗，必须在一段时间后补充。

3.反应器培养液的灭菌与接种培养

生物反应器的灭菌时采用夹套层蒸汽预热后直接或间接通入饱和蒸汽灭菌的方式进行的，可将反应器内培养液的温度升至121℃，以达到灭菌的效果。

灭菌后的培养基冷却至培养温度后，即可接种培养。

接种时，严格按照无菌操作进行，避免杂菌污染。

4.补料、取样

生物反应器的补料（酸碱、消泡剂及其他营养液）可通过蠕动泵进行，可自动也可手动；

取样时了解发酵过程的重要手段，取样时，严格按照无菌操作进行，避免杂菌污染。

三、实验步骤

1.准备工作

首先拧下螺栓，启动自动升降机，打开上盖，检查培养罐内部是否清洗干净。

插入校正完毕的pH电极和氧电极与罐侧面相关位置，并与控制连接。

加入配置好的培养液，加盖并对称地拧紧螺母，直至上盖被密封固定。

安装安全阀、泡沫传感器、观察灯、压力计、取样管及空气过滤器等，剩余的孔洞需用硅胶塞拧紧备用。

使用完毕后拆卸时与以上步骤相反，并彻底清洗罐体及零件。

2.pH校正

此步骤必须于发酵罐灭菌前先校正，再将电极插入罐内。

（1）将电极置入零点标准液里（7.00），看pH稳定后按7.00（ZERO下方）。

此时pH显示值（PV）会显示7.00

（2）将电极用纯水洗涤，置入标准液里（4.00），看pH稳定后按4.00键（SPAN下方）。

此时pH显示值（PV）会显示4.00

（3）将电极置入标准液里（7.00），看pH之量测值是否显示正确。

（4）如尚有误差，请重复

（1）、

（2）步骤。

注意：

用于发酵过程中经取样量测。

如发现与显示值有偏差，请调整使显示值正确。

此数值乃将取样量测值减显示值之误差量输入。

3.DO校正

此步骤必须于发酵罐灭菌后罐内温度稳定时才能进行。

（1）将电极讯号线接头拆开，看DO之量测值稳定后按0键（ZERO下方）。

DO显示值会显示0.0。

（2）将电极讯号线接头街上，槽内通气至饱和。

看DO之量测值稳定后按100键（SPAN下方）。

此时DO显示值会显示99.9。

（3）将电极讯号线接头拆开，看DO量测值是否显示正确。

4.反应器的灭菌和发酵

1）灭菌

此系统在灭菌状态前需将灭菌的条件作业准备妥当，包括以下几个方面：

（1）罐体洗干净后将顶板降下并锁紧（切记此步骤完成后方可将控制启动）。

（2）再次确定顶板盖是否已完全紧密，各接口是否已安装上并锁紧，空气过滤器是否已安装或确定可用。

（3）pH先行校正完成并插入槽内，DO电极插入槽内（DO灭完菌后温度至发酵温度后再校正）。

（4）将培养基装入罐内，并确认容量足够高于各感测电极。

（5）加料液及管件是否已事先灭菌准备完成。

（6）顶板不用的接口是否已拴紧。

（7）检查电极孔及取样口是否已定位锁紧，各供应源是否已准备好（空气、冷却水、蒸汽）。

（8）完成上述所有步骤后即可开始灭菌。

确定所设定灭菌条件正确后，将搅拌、温度、流量控制开关启动，开启灭菌开关开始灭菌。

灭菌完成后系统会自动冷却，待冷却程序完成后系统会警报警示。

之后将系统切至发酵即可开始发酵。

2）接种与培养

通入反应器的空气从空压机经空气过滤器而成无菌空气，再由空气分布管送入灭过菌的培养罐内。

在控制台上，设定所需的搅拌转速、发酵温度、pH，并将空气流量计的流量调至确定值，DO校正。

将事先培养好的培养液（在三角瓶中进行摇床培养，处于对数生长期的细胞，以无菌操作方式倒入已灭菌的、带有插在保险管套筒内的注射针及软管的三角瓶内；

或直接倒入三角瓶种子）由接种口接入罐内。

接种时，要在接种口的隔膜周围放上浸有乙醇的棉花或用1~3ml乙醇覆盖，点燃，以产生上升的气流来防止杂菌污染。

接种塞从无菌筒内取出，然后将接种针穿过火焰和隔膜，慢慢插入中心部位，拧紧连接螺帽，直至插入部分固定。

接种量大体上是培养液的百分之几。

5.补料、取样

当调节pH和泡沫时，可将酸液或碱液及消泡剂装入三角瓶，灭菌后，分别经蠕动泵与反应器连接，补料与之相同。

这样，通过控制台的自动控制，就可以自动地连接流加。

为了了解培养过程中反应物的变化，必须定时进行取样。

取样前，要先Udine取样口进行灭菌后再取样；

取样时关闭排气口，使罐内处于正压状态，打开取样口，培养液即可自动流出。

但是，在下次取样时，必须注意将残夜放干净后再取样。

四、思考题

（1）为什么pH电极在生物反应之前要进行校正？

答：

pH电极在使用一段时间后,特别是经过低温消毒后,电机内部的参比电极、缓冲液等的理化性质都会发生或多或少的变化,造成漂移,因此每次使用前都要纠正这一偏差

（2）在pH电极的校正操作过程中应注意哪些注意事项？

1.校准时请注意采用新鲜的缓冲液。

缓冲液配制后一周内使用。

2.电极在缓冲液中放置1分钟再进行后续操作。

3.冲洗电极后只能用柔软的纸巾吸干水分，切勿摩擦pH敏感膜。

4.电极校准周期根据不同的使用环境和精度要求而定，在保证精度的前提下确定适当的校准周期

（3）为什么在生物反应之前要对DO电极进行校正？

是否每次反应都必须校正？

为什么？

因为漂移和膜堵塞是DO电极在使用中面临的主要问题。

经过消毒后，电极输出很难做重现。

因此，电极在生物反应之前要校正。

不是每次反应都必须校正DO电极，经过一次校准后可连续使用二周甚至更长时间。

通常2～3月应重新校验一次溶氧仪电极的零点和量程。

只要测量显示DO值是准确的就不需要频繁对电极进行标定。