间接ELISA测定血清中RI含量方法的建立图文精Word格式文档下载.docx

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所以磨玻璃样改变少见嘲。

总之．正确认识骨骼弯锄畸形与病灶内的纤维组织有着密切联系这一现象。

对鉴别诊断、尤其是与非骨纤维病变韵鉴别

【３】段承祥，王晨光，李键丁．骨肿瘤影像学【ＭＨＥ京：

科学出版社，２００４．２４６．

【４１王玉凯．骨肿瘤Ｘ线诊断学【Ｍ】．北京：

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射学杂志，２００３，１９（９）：

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ｆ７】张显秋．骨性纤维异常的诊断与治疗【Ｊ】．实用骨科杂志，２００２，２：

１１０．ｆ８】ＳｃｈａｊｏｗｉｅｚＦ，ＳｉｓｓｏｎｓＨＡ，ＳｏｂｉｎＬＨ．ＴｈｅＷｏｒｌｄＨｅａｌｔｈＯｒｇａｎｉｚ－

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ｅｄｉｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ，１９９５，７５：

１２０８．

［９】彭明惺，谭永淑，刘利君．骨性纤维发育异常【Ｊ】．中华骨科杂志，１９９９，

１９（３）：

１８０．

收稿日期：

２００６－０２—２４

间接ＥＬＩＳＡ测定血清中ＲＩ含量方法的建立

刘

宇１，刘基巍２，燕秋３，崔秀云３

（１．大连市第三人民医院肿瘤科，辽宁大连１１６０３３；

２．大连医科大学附属第一临床学院肿瘤科，辽宁大连１１６０１１；

３．大连医科大学生化和分子生物学教研室，辽宁大连１１６０２７）

【摘要】固钓：

建立检测廒清中核糖核酸酶抑制因子（ＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＲＩ）含量的间接酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ），并分析该方法的特异性和敏感性。

方法：

用血清样品包被酶标板，兔抗人砒抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体为二抗，建立血清砒定量检测的间接ＥＬＩＳＡ法。

结果：

所建立的用于血清中ｍ含量检测的间接ＥＬＩＳＡ方法特异性好。

灵敏度高。

结论：

间接ＥＬＩＳＡ法可以用于测定血清中的ＩｔＩ抗原含量。

具有良好的灵敏度和稳定性，能够有效的反映出人血清中韵ｍ表达情况。

【关键词】核糖核酸酶抑制因子；

间接酶联免疫吸附试验

文章编号：

１００９—５５１９（２００６）１２—１７７４—０３

Ｅｓｔａｌ碡ｉ．／ｎｔ

中图分类号：

Ｒ４４６文献标识码：

Ａ

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【触嘣】侧耐饨：

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【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ＲｉｂｏｎｕｅｌｅａｓｅＩｎｌ－ａｈｉｔｏｒ（ＲＩ）；

ＩｎｄｉｒｅｃｔＬｉｎｋｅｄＩｌｎｌｎｌｌｎｅ－ｏｓｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）

酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）是目前在生物学和生物化学研究以及临床检验工作中应用较为广泛的一项技术。

核糖核酸酶抑制因子（ｒｏｂｅｎｕｅｌｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＲＩ）是一种分子量约为５０ｋＤ的酸性糖蛋白ｆｌ】，可以与血管生长因子（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ，Ａｎｇ）紧密结合，从而阻断肿瘤新生血管形成，有效地抑制肿瘤的生长。

目前，检测砒最常用的方法是免疫印迹，该方法只能用于半定量测定。

且操作复杂、费时。

本实验将间接ＥＬＩＳＡ法用于Ｉｕ的测定。

研究

１资料和方法

Ｌ１资料：

（１）血清样品：

对照血清为随机抽取的正常人血清。

（２）抗原抗体：

ｍ标准品、抗Ｉｕ抗体（一抗，Ａｂｌ）均由大连医科大

学生化和分子生物学教研室制备并纯化闰，ＨＲＰ标记的羊抗兔抗体（二抗，Ａｂ２）由大连联星生物公司提供。

（３）底物Ａ、Ｂ，终止液，洗涤液均购自上海实业科华公司，包被液、封闭液、洗涤液、抗体缓冲液均为自行制备。

（４）９６孔酶标板购自美国Ｃｏｓｍｒ公

间接ＥＬＩＳＡ法定量测定包被在酶标板上的ｍ抗原的可行性．以

期为砒的研究找到一种特异性强、灵敏度高、操作简单、快捷的新方法。

司，ＥＬＸ８００酶标仪、洗板机为美国ＢＩＯ＿１圈（公司产品，ＰＨＳ一托

型精密ＰＨ计由上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂生产。

１．２方法

万方数据　

现代医药．Ｘ生－２００６年２２卷ｇ１２期

１．２．１间接ＥＬＩＳＡ法检测血清中ＲＩ含量：

取血清样品用包被液稀释成不同浓度（１：

２５、ｌ：

５０、１：

１００）后，取５０ＷＩｉＪＵ入到酶标板各孔中，每个样品包被６孔，４０Ｃ过夜。

洗板后每孔加封闭液１００ｍ，３７℃孵育１．５１１，时。

每个样品中取三孔加入用抗体缓冲液稀释４０００倍的一抗５０“，作为反应孔，其他三孔只加抗体缓冲液５０山，作为空白孔，３７℃孵育ｌ／ｂ时。

将酶标记二抗稀释至２０００倍，各孔加５０汕ｌ，３７℃孵育４０分钟。

每孑Ｌ加入底物Ａ和Ｂ各５０山，混匀后３７℃孵育１３分钟，每孔加终止液５０山终止反应。

用酶标仪在４９０ｎｍ波长处读取各孔吸光度值。

用反应孔平均值减去空白孔平均值得各样品的光密度值（Ａ４９０ｎｍ）。

１．２．２线性分析：

包被梯度稀释的ｍ标准品于酶标板上，用上述间接ＥＬＩＳＡ法测光密度值（Ａ４９０ｎｍ）

１．２．３精密度测定：

包被同一份血清．其他条件不变，比较同一酶标板和不同酶标板的吸光度，计算其变异系数（ＣＶ）。

１．２．４特异性测定：

通过Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹法检测ＲＩ标准品、血清中的Ｉｕ与ＲＩ抗体间有无特异性反应。

１．２．５血清中抗原的稳定性测定：

在无污染情况下。

新鲜分离血清标本４０Ｃ存放ｌ周。

一２０ｃＣ存放１月．取不同时间的标本每孔包被１Ｕ，其他条件不变通过ＥＬＩＳＡ法测定后，观察光密度值，进行稳定性分析。

２结果

２．１灵敏度与线性分析：

光密度值在０．１—１．２范围内所对应的血清稀释度在１：

２５～１：

８００之问皇直线关系，如图１，回归方程为Ｙ＝２３。

２５Ｘ＋０，２３５，了＝ｏ．９７３（Ｐ＜０．００１）。

１．哇１．２

嚣ｏ．８１

鬃爱ｉ

ｏ．２Ｏ０

０．０２

０．０４

ｏ．０６

血清稀释度

圉１

血清稀释度与光密度值问的关系

２．２精密度检测：

见表１。

检测结果表明ＣＶ分别为批内８．２９％。

批阅１０．２０％，均小于１５％。

表１

批内和批阍光密度值比较

２．３特异性：

Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹法转移后的硝酸纤维素膜经与蛋白分子量标准对照后，在约４３ｋＤ处瞰标准品和血清中均有特异条带出现，为Ｉｕ的位置，说明ｍ抗体只与Ｉｕ结合，而与其它蛋白无反应（见图２）。

２４血清中抗原的稳定性：

当天测得光密度值为０．６５４、１周测得值Ｏ．６９０、２周０．８６７、３周Ｏ．７９５、１月０．７２１。

因此不同时间测得的光密度之间的ＣＶ为１１．３６％。

小于１５％。

说明标本存放一定时间对检测结果无明显影响。

３讨论

万　

方数据１７７５

图２

ＲＩ抗体特异性分析

肿瘤是危害人类健康的主要疾病之一，新生血管的生成对于肿瘤的生长和转移是必须的：

在正常成年人体内，血管生成几乎是静止的，只有Ｏ．０１％的内皮细胞处于分裂期圈，外源性限翩血管的生成可以明显地抑制肿瘤的生长，甚至可以使肿瘤消退１４１。

ＲＩ是一种分子量为５０ｋＤ的酸性糖蛋白，Ａｎｇ具有强烈的诱发血管生成活性，ｍ与Ａｎｇ具有较高的亲和力。

ＲＩ作为Ａｎｇ的高效抑制剂．在与Ａｎｇ结合后即可以产生抑制其促进血管生成活性的作用，抑制瘤体生长与转移嘲。

因此，研究Ｉｕ在抗肿瘤血管生成治疗中的作用具有重要的意义。

目前检测ｍ最常用的方法是免疫印迹，该方法只能用于半定量测定，且操作复杂、费时。

用于蛋白、多肽类检测的方法很多．ＥＬＩＳＡ法因其灵敏度高、精确度好、特异性强、操作简便快捷等特点而被广泛应用于蛋白、多肽类的检测【研。

我们利用间接ＥＬＩＳＡ法可以用于抗原或抗体检测的原理，对人血清中的ＲＩ抗原含量进行测定。

并对此方法的特异性、敏感性和精密度等作了研究．确定了本方法的可靠性和实用性。

ＥＬＩＳＡ法的基本原理为抗原与抗体的特异性反应，因此，ｍ抗原能与抗ＲＪ抗体（一抗）之间能否产生特异性结合是本次实验的关键。

我们通过Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹法证实了这一点，为在接下来的实验中使用础抗体提供了依据。

在ＥＬＩＳＡ检测中，影响结果的因素很多，其中最重要的是