小鼠精子和球形精子细胞显微注射受精研究Word格式.docx

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单位：

李子义谭景和　孙兴参　刘忠华　周琪　贺桂馨　东北农业大学生物工程系，哈尔滨　150030

关键词：

精子；

球形精子细胞；

显微注射；

电活化；

电融合；

小鼠

　　【摘要】　目的　研究动物受精机理。

　方法　以昆明白鼠为实验动物，利用显微注射技术，对精子和球形精子细胞的显微注射受精进行了研究。

结果　1.带下注射受精，注射4～6个精子的卵的受精率（32.5%）和卵裂率（25.0%）显著高于注射单个精子的卵的受精率和卵裂率（分别为12.5%和6.3%）（P＜0.05）。

2.带下注射4～6精子后，有第1极体卵母细胞的存活率（69.6%）、受精率（32.5%）和卵裂率（25.0%）分别高于无第1极体卵母细胞的存活率、受精率和卵裂率（分别为64.4%、20.7%和13.8%），但两者无显著差异（P＞0.05）。

3.胞质内精子注射卵的存活率（21.4%）极显著低于带下注射卵的存活率（69.6%）（P＜0.01）；

而胞质内精子注射卵的受精率（35.5%）、卵裂率（32.3）%和囊胚率（20.0%）则高于带下注射卵的受精率（33.3%）、卵裂率（25.0%）和囊胚率（10.0%），但无显著差异（P＞0.05）。

4.将球形精子细胞注入经电活化处理的卵母细胞的透明带下，注射卵的存活率为90.5%，电融合率为34.6%，2-细胞分裂率为28.3%。

　结论　1.注射精子的数量对小鼠带下注射的受精率和卵裂率有显著影响。

2.卵母细胞中第1极体存在与否对小鼠带下注射的受精率和卵裂率无显著影响。

3.不同注射方法对小鼠卵的存活率有极显著的影响，而对受精率、卵裂率和囊胚率无显著影响。

4.本实验所采用的电融合条件，尚未满足多数球形精子细胞与卵母细胞融合之需要。

FERTILIZATIONBYMICROINJECTIONOFSPERMATOZOONANDROUNDSPERMATIDINTOOOCYTEINTHEMOUSE

　　LiZiyi，TanJinghe△，SunXingshen,LiuZhonghuan,ZhouQi,HeGuixin

（DepartmentofBiotechnology,NortheastAgriculturalUniversity）

　　【Abstract】ObjectiveTostudyfertilizationmechanisminmammalsandprovideessentialdatafortreatinghumanmaleinfertility.Methods　Usingmicroinjectiontechnique,thefertilizationbymicroinjectionofspermatozoaandroundspermatidsintooocytesinthemousewassystematicallystudied.Results　1.Followingsubzonalinjectionofspermatozoaintooccytes,thefertilizationrate（32.5%）andcleavagerate（25.0%）intheoocytesinjectedwith4-6spermatozoaweresignificantlyhigher（P＜0.05）thanthose（12.5%and6.3%,respectively）intheoocytesinjectedwithasinglespermatozoon.2.Followingsubzonalinjectionof4-6spermatozoaintotheoocytes,thesurvivalrate（69.6%）,fertilizationrate（32.5%）andcleavagerate（25.0%）inthoseoocyteswithpolarbody1（PB1）werehigherthanthose（64.4%,20.7%and13.8%,respectively）intheoocyteswithoutPB1,butthedifferencewasnotsignificant（P＞0.05）.3.Thesurvivalrate（21.4%）intheoocytesinjectedwithasinglespermatozoonintothecytoplasmwassignificantlylower（P＜0.01）thanthat（69.0%）intheoocytesinjectedwith4\|6spermatozoaintotheperivitellinespace（PVS）.Thefertilizationrate（35.5%）,cleavagerate（32.2%）andblastocystrate（20.0%）inthoseoocytesinjectedwithasinglespermatozoonintothecytoplasmofoocyteswerehigherthanthose（33.3%,25.0%and10.0%,respectively）intheoocytesinjectedwith4-6spermatozoaintothePVS,buttheydidnotdiffersignificantly（P＞0.05）.4.Followingsubzonalinjectionofaroundspermatidintotheoocyte,thesurvivalrate,electrofusionrateand2-cellratewere90.5%,34.6%and28.3%,respectively.Conclusions　1.Thefertilizationrateandcleavagerateintheoocytesweresignificantlyaffectedbythenumberofsubzonalinjectionofspermatozoa.2.Thesurvivalrate,fertilizationrateandcleavagerateintheoocyteswithPB1orwithoutPB1werenotsignificantlyaffectedwhensubzonalinjectionofspermatozoa.3.Thesurvivalrateintheoocytesweresignificantlyaffectedbyinjectionmethods,andthefertilizationrate,cleavagerateandblastocystrateintheoocyteswerenotsignificantlyaffectedbyinjectionmethods.4.Mostroundspermatidsandoocyteswerenotfusedonthepresentconditionofelectrofusion.

　　【Keywords】Spermatozoon;

Roundspermatid;

Microinjection;

Electricalactivation;

Electrofusion;

Mouse

　　正常的受精过程，精子必须穿过透明带并与卵质膜融合而进入卵中。

随着显微操作技术和设备的日趋完善，使得由透明带和卵质膜所形成的人工授精障碍能够得以排除。

胞质内精子注射（intracytoplasmicsperminjection,ICSI）或带下注射（subzonalinjection,SUZI）,是利用显微操作仪将精子（或精子细胞）直接注射到卵胞质内或透明带下的受精过程，称为显微注射受精（microfertilization）或显微操作协助受精（micromanipulation-assistedfertilization）［1］。

它是体外受精与显微操作技术相结合而形成的一项新技术，该技术在动物受精机理研究、治疗男性不育、动物育种和野生动物遗传资源保存方面，有着极为广阔的应用前景。

小鼠带下注射受精已于1998年有子代出生［2］，而小鼠胞质内精子注射的研究一直进展缓慢。

到1995年，Kimura等［3］改进了显微操作系统，Ahmadi等［4］先向胞质内注入Ca2+、再注入精子，先后获得小鼠胞质内精子注射受精后代。

　　尽管已有后代出生，但有关精子（或精子细胞）显微注射受精的基础理论研究还很少。

本实验以小鼠为实验动物，利用显微注射技术，对精子和球形精子细胞显微注射受精进行了研究，旨在为深入研究动物受精机理，以及为治疗男性不育等提供基础数据。

材料和方法

　　1.动物选择

　　实验用昆明白鼠，雌鼠6～8周龄、体重25～35g，雄鼠8～12周龄、体重35～45g，购自哈尔滨市制药厂实验动物室，按常规方法饲养管理。

　　2.卵子准备

　　雌鼠腹腔注射10IU孕马血清促性腺激素（PMSG），间隔48h腹腔注射10IU人绒毛膜促性腺激素（hCG），进行超排卵处理。

注射hCG后16h，以颈椎脱臼法处死雌鼠，剪下输卵管，在实体解剖镜下，用眼科镊子划破输卵管壶腹部收集卵丘团。

卵丘团经0.1%透明质酸酶（Sigma公司）处理1～2min（37℃），去掉卵丘细胞，获取的卵母细胞置Hepes-CZB［5］液中洗3次后备用。

　　3.精子与球形精子细胞准备

　　以颈椎脱臼法处死雄鼠，取双侧附睾尾及部分输精管中的精子，移入含有1mlT［6］6液的小管中，用封口膜封住管口后，放入37℃温箱中待用。

采用带下注射时，精子在T6液中获能2h（37℃温箱中）；

胞质内注射时，可免去精子获能步骤，直接将1份精子悬液与3～4份用T6液配制的含10%聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrolidone,PVP）滞动液混合待用。

球形精子细胞的制备参照Ogura等［7］方法进行。

即取小鼠睾丸，剥离睾丸被膜，用眼科剪刀剪碎曲细精管，置Hepes-CZB中离心2次（1000r/min，5min／次），取沉淀物的表层置操作液滴中，球形精子细胞体积很小，直径约10μm（9～11μm），细胞中央有染色质团构成的轮廓明显的球形区。

　　4.显微操作工具制备

　　将1.2mm×

150mm玻璃毛细管，手工拉制成外径130～150μm的吸管，然后在微锻仪上加工成内径约20μm的固定吸管。

将1.2mm×

150mm玻璃毛细管，经拉针仪、磨针仪和微锻仪制成注射针管。

用于ICSI的注射针管内径为6μm，用于SUZI的注射针管内径8～10μm，用于球形精子细胞带下注射的注射