TPA诱导K562细胞分化过程中线粒体铁蛋白表达情况研究Word文档格式.docx
《TPA诱导K562细胞分化过程中线粒体铁蛋白表达情况研究Word文档格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《TPA诱导K562细胞分化过程中线粒体铁蛋白表达情况研究Word文档格式.docx（5页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
【关键词】TPA；
K562细胞；
线粒体铁蛋白；
运铁蛋白受体Ⅰ；
铁蛋白
ExpressionofMitochondrialFerritininK562LeukemicCellduringTPAInducedCellDifferentiation
AbstractMitochondrialferritin（MtF）,anewplayerinironmetabolism,firstidentifiedin2001,ishighlyhomologoustoferritinbothstructurallyandfunctionally.PreliminarystudieshavesuggestedthatMtFmightplayveryimportantrolesintheregulationofmitochondrialironhomeostasis.Leukemiccells,justlikeothermalignantcells,demandmoreironfortheirgreaterproliferationpotential.However,littleisknownaboutwhatrolesMtFmightplayinleukemiccellironmetabolismandcellproliferation.TheaimofthisstudywastoinvestigatetheexpressionofMtF,transferrinreceptor1（TfR1）andferritin（Fn）mRNAsinK562leukemiccellsduringTPAinducedcelldifferentiationandtoexploretheinterrelationshipbetweentheexpressionlevelsoftheseironmetabolismrelatedmolecules.K562cellsculturedwithorwithoutTPA（16nmol/L）werecollectedat24,72and120hoursrespectively.Celldifferentiationtowardmonocytelineagewasconfirmedbymicroscopicstudy（Wright‘sstaining）andflowcytometry.SemiquantitativeRTPCRwasperformedtodeterminemRNAexpression,withhousekeepinggeneβactinascontrolreference.Thisstudyrevealedthatover95%ofK562cellsshowedmorphologicalfeaturesofmonocyte/macrophage，andtheexpressionofCD64oncellsurfaceincreasedsignificantlyatday5withTPAtreatment.K562cellscouldexpressacertainlevelofMtFbeforeTPAinduceddifferentiation.WithincreaseofTPAinducedcelldifferentiation,MtFmRNAexpressionsweredownregulatedprogressively.After5daysofinducedcelldifferentiation，expressionlevelsofMtFandTfR1mRNAwerejust%and%ofthatbeforeTPAtreatment.WhileFnmRNAexpressionincreasedto foldsofthatbeforeTPAtreatment.ItisconcludedthatMtFexpressionisdownregulatedduringTPAinducedK562celldifferentiation,withconcomitantdownregulationofTfR1andupregulationofFn.ThecoordinatedexpressionregulationofthesekeyironmetabolismrelatedmoleculesduringcelldifferentiationmayinturninhibitTfR1mediatedironuptakeviaendocytosisandthusadverselyaffectcellproliferationpotential.
线粒体铁蛋白（mitochondrialferritin,MtF）是2001年才发现的一种铁代谢相关分子，与胞浆铁蛋白具有很高的同源性，也具有亚铁氧化酶活性和铁结合能力，但其表达局限于线粒体［1］。
国外初步研究表明，MtF为线粒体内的铁存储蛋白，MtF的表达可使胞浆内铁向线粒体内转运，降低胞浆"
可变铁池"
水平，细胞呈"
缺铁状态"
，并通过铁调节蛋白和铁效应元件的相互作用在转录后水平上协调调节运铁蛋白受体1（transferrinreceptor1,TfR1）和铁蛋白（ferritin,Fn）表达水平［2］。
MtF在细胞铁稳态调节方面可能具有十分重要的作用。
中国实验血液学杂志JExpHematol2007;
15
（2）K562细胞诱导分化过程中线粒体铁蛋白表达情况研究线粒体是细胞代谢最为旺盛的细胞器，是血红素和铁硫蛋白合成的主要场所，也是活性氧自由基产生的重要部位［3,4］。
白血病细胞增殖代谢旺盛，对铁的需求大，但目前对白血病细胞线粒体铁代谢了解很少。
为此，我们采用TPA体外诱导K562白血病细胞定向分化动态研究了K562白血病细胞诱导分化过程中MtF、TfR1和胞浆FnmRNA表达的变化情况，探讨MtF在白血病细胞线粒体铁代谢调节方面的作用，为建立针对铁代谢途径的白血病治疗新策略奠定理论基础。
材料和方法
材料和仪器
K562细胞株由四川大学华西第二医院实验中心提供。
RPMI1640培养液为美国Gibco公司产品，特级小牛血清为海克隆生物化学制品有限公司产品，TPA为晶美生物工程有限公司产品，TRIZOL试剂为北京天为时代科技有限公司产品，RevertAidTMFirstStandcDNA合成试剂盒为晶美生物工程有限公司产品，PCRMasterMix试剂盒为北京天为时代科技有限公司产品，流式细胞仪为CoulterEPICSELITEESP产品，PCR仪、凝胶图象分析系统为UVP公司产品。
RTPCR引物
参照有关文献设计［1］，由Invitrogen公司合成。
MtF上游引物序列：
5‘TATTTCCTTCACCAGTCCCGG3‘；
MtF下游引物序列：
5‘GCAGGAGACAGCTGACTTTGG3‘，MtF扩增产物长度451bp。
TfR1上游引物序列：
5‘AGCACAGACTTCACCAGCACC3‘；
下游引物序列：
5‘GTCCCCAGATGAGCATGTCC3‘，扩增产物长度506bp。
Fn上游引物序列：
5‘CCTCCTACGTTTACCTGTCC3‘；
下游引物序列：
5‘GCTTGTCAAAGAGATATTCC3‘，扩增产物长度429bp。
内参照βactin上游引物序列：
5‘CCAAGGCCAACCGCGAGAG3‘，下游引物序列：
5‘AGGGTACATGGTGGTGCCGC3‘，扩增产物长度587bp。
K562细胞培养
K562细胞复苏后加RPMI1640培养液在37℃、5%CO2、饱和湿度孵箱中悬浮培养。
实验分组
用无血清RPMI1640培养液将K562细胞悬液调整至浓度为5×
105/ml，加入6孔板中，每孔接种量1×
106个细胞，置于37℃、5%CO2、饱和湿度孵箱中进行培养。
实验组为TPA诱导分化培养组和对照组，前者根据预实验结果，确定TPA终浓度为16nmol/L，对照组为K562细胞普通培养。
每孔共设3个复孔。
细胞形态观察
收集各时点的实验组和对照组K562细胞，用PBS洗涤2次，离心涂片后瑞氏染色，凉干后油镜下观察细胞形态，每片计数200个细胞，计算诱导分化率。
诱导分化率=×
100%
细胞表面CD64表达的流式细胞术检测
收集各时点的实验组和对照组K562细胞，于四川大学华西医院肿瘤生物治疗中心检测细胞CD64表达水平。
半定量RTPCR
细胞总RNA采用TRIZOL试剂盒提取制备，按照产品说明书进行。
cDNA第一链合成采用RevertAidTMFirstStandcDNA合成试剂盒。
进行逆转录条件为：
mRNA模板μg，OligodT1μl，加DEPCH2O至总体积为12μl，70℃恒温5分钟后，冰上冷却；
再加入buffer4μl，inhibitor1μl及dNTP2μl，37℃恒温5分钟；
最后加MMuLV逆转录酶1μl，42℃1小时，70℃10分钟，冷却。
PCR扩增采用2×
TaqPCRMasterMix试剂盒。
MtFPCR条件为94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，30次循环后72℃恒温10分钟。
TfR1的PCR条件为：
94℃2分钟，94℃45秒，60℃30秒，72℃45秒，30次循环后，72℃10分钟。
Fn的PCR条件为：
94℃2分钟，94℃45秒，56℃30秒，72
升级会员 