包涵体变性复性及纯化Word格式文档下载.docx
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buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的,但是我觉得你的做法只是在鉴定有无表达,用loading
buffer是没有问题的.
2、表达重组蛋白时，细菌裂解方法都有哪些？
在表达重组蛋白时，诱导以后跑SDS-PAGE发现表达都很好，但是在裂解细胞时遇到问题。
总是不能彻底裂解细胞。
首先我采用超声裂解，可是不管我如何超声总有部分细菌没有裂解。
我的超声条件如下：
宁波新芝超声细胞破碎仪，功率400W，超5秒，间隔5秒，重复99次。
然后显微镜观察，不彻底时再重复99次。
菌体来自200
ml培养液，用20
ml
PBS重悬。
然后我又尝试加溶菌酶，首先加至终浓度100
ug/ml，4C半小时菌液不变粘，加大浓度至1
mg/ml，半小时后仍无明显变化。
因为我用的PBS是pH7.4，我怀疑是pH不合适，换用pH8.0
TE
buffer，1
mg/ml溶菌酶，4C半小时仍无明显变粘。
因为这次使用的溶菌酶是前一天配好的，担心溶菌酶失效，重新称取冻干粉末，直接加入菌液，仍然没有明显变化。
真是郁闷。
到底出了什么事？
请高手解答，并介绍优化的方案。
同时希望能介绍一下如何选择细胞破碎方法，以及如何确定最佳条件。
溶菌酶在pH7.4时是否没有活性了？
可否配成浓缩液保存溶菌酶，如果可以，应如何保存？
加入溶菌酶以后，如果细胞壁已破坏，菌液应该变粘吧，因为核酸被释放出来。
而超声破碎细胞，我觉得菌液是不会变粘的，因为超声可以把大分子核酸打碎成小片段。
我判断细胞破碎不完全是因为，在将破碎后样品离心分离上清和沉淀跑SDS-PAGE观察，发现在细胞碎片组分中除了经常出现的一两条带以外，还有菌体总蛋白样品中的很多带出现。
据此可以判断细胞只是部分破碎。
不知我的分析是否正确，请版主和各位高手指教。
如果溶菌酶效果还可以，我觉得先用溶菌酶初步裂解细胞，然后再用超声进一步破碎并断裂大分子核酸以降低粘度的细胞破碎策略可能比较好。
因为超声有可能使蛋白变性，但单用溶菌酶不能确定是否完全破碎，还要再加核酸酶降低粘度。
这种两步法策略应该还可以减少破碎条件优化的时间。
我用的溶菌酶放置时间比较长了，有可能失活了。
我刚从生工又定了一支，不过得后天到货，但愿它有用。
如何观察溶菌酶是否已裂解细胞，通过观察粘度变化是否可以？
只反复冻融是否可以有效裂解大肠杆菌细胞？
溶菌酶只有在pH值大于8.0的条件下才能发挥溶菌作用，请务必保持PBS的pH＞8.0，同时溶菌酶的量一定要足！
在加入溶菌酶后，最好放于磁力搅拌器上搅拌30分钟，再进行超声破菌，我的超声条件是：
功率400W，工作2秒，间隔2秒，重复199次。
菌体来自500
ml培养物，用30
PBS重悬，超声效率还是可以的。
哪儿的溶菌酶好用？
我用生工的溶菌酶，称取干粉20mg。
200ml菌液用18
NaCl重悬，加入2
25mM
Tris-HCl（pH8.0），将溶菌酶干粉加入体系，混匀，测pH降低到5－6，加20
ul
2M
Tris碱，体系pH升到～8。
4C放置1小时，菌液上层变澄清，摇动发现体系没有变粘。
测pH仍在8左右。
再37C保温1小时，还没有变化，我简直不知如何才好了。
另一瓶200ml培养物，溶菌酶处理1小时后超声。
条件：
300W，超5秒停5秒，重复99次。
菌液有变化，但很不明显。
继续超声400次，从外观来看没有太大区别。
我简直要说tmd了。
见鬼了。
我的操作有什么地方不妥当，请各位指正。
溶菌酶的厂商要求是否很重要？
我的诱导物来自1：
20过夜培养物接种，37C生长3小时后30C诱导2小时（0.8mM
IPTG）。
是否菌液太浓，Pharmacia的说明书200
ml培养物用10
ml重悬，我用20
ml，仍然不够稀？
有人告诉我菌液应该稀一些，200
ml用30－40
ml重悬。
但实际操作也不够理想。
SDS-PAGE总是观察到细胞破碎效果不够彻底。
超声那么多次，蛋白都要被超碎变性了。
3、酵母的破碎
酵母是一类单细胞真菌的总称，其成员分别属于不同的真菌纲，细胞壁成分是否会有较大差别，这些都是做破碎酵母细胞前要考虑的。
我归纳了一下，做破碎酵母的几种方法：
1
机械的方法：
一般的PROTOCOL都是用glass
beads：
如
sigma
G-8772，加玻璃珠后超声，蛋白活性保持较好。
2
化学裂解的方法：
10g酵母
加1ml的乙酸乙酯，充分搅拌至液体状（希望高手点评）
3
尿素裂解液（尿素8mol/L,
NaCl
0.5mol/L,Tris
20mmol/L,
EDTA
2%SDS,
PH值8.0）高压匀浆。
（这个好象也该在方法2中）
4
液氮冻融并研磨酵母破壁，我认为这种可能在小试中比较合适。
5
温和的酶法，可能不会会破坏酵母原生质体
酶法裂解主要用两种酶：
1。
蜗牛酶，可以直接从蜗牛的胃液中获得；
2。
lyticase，可以从sigma定购。
这两种酶解法都可以和上面的几种方法结合使用，尤其是glass
beads方法，效果很好。
我用过化学裂解的方法，10g酵母
加1ml的乙酸乙酯，充分搅拌至液体状。
此法的裂解效果不错的，不妨试一下。
一篇文章是加尿素裂解液（尿素8mol/L,
PH值8.0），据说效果可以
酵母破碎效果好的我所做过的方法中还是玻璃珠，就象microbe
和rongjunli所说的那样，效率很高的，而且对目的蛋白活性不会有什么影响。
一般应该用这个方法。
4、超声破碎的条件选择
超声破碎的条件不能一概而论，要看你的实验要求，有的是细菌破碎，有的是对组织细胞进行破碎，要掌握好功率和每次超声时间，功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，必要时在冰浴条件下进行超声破碎。
至于每次超声时是否起泡沫到不是关键的问题，这与你超声的量明显有关。
5、如何鉴定细菌超声破碎的程度
最简单的方法：
涂片--革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟---显微镜观察
切记：
只用结晶紫染色，别忘了染色后再用水稍冲洗一下
6、细菌裂解的DNaseI
不同纯度的酶换算标准不同，所以你最好查查是哪个公司的酶？
仔细看说明书，可能会有换算说明。
另外看一下参考文献所用的酶是哪个公司的，到该公司的主页也可能有收获。
我用过华美和TAKARA的DNA酶，华美的是用mg/ml。
华美也有RNase
free的DNA酶，定量用活性单位。
TAKARA的两种酶都是用活性单位定量的。
我在超声裂解细菌时加入一些DNA酶，一般用超声液加不同量的酶做一个预实验，选取符合你需要的酶量。
其实根据目的和方法的不同，所需要的酶量也是可调节的，比如酶切温度（16度或37度）。
7、超声裂解细菌是否完全？
只用结晶紫染色
二、包涵体的洗涤
1、包涵体的洗涤问题
通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。
包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。
此外刚处理完的包涵体好溶解。
冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。
如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。
2、如何得到比较纯的包涵体
对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。
包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。
洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和
NP40等加EDTA和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50
mM
NaCL。
这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。
也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。
EDTA为0.1-0.3
mM。
去垢剂如Triton
X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp
T（37
KDa）在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。
对于尿素和盐酸胍的选择：
尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。
盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。
但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。
包涵体最后的纯化，一般是离子交换，疏水，或者是亲和层析，亲和层析尤其是金属螯合层析用得比较广泛，而纯化的效果也不错，通常是一步就能达到纯度为95%以上的包涵体。
8M高浓度尿素溶解后离心获得的包涵体溶解液，放在4度冰箱过夜后出现沉淀，这种现象我也在实验中遇到过;
开始感觉很奇怪，后来发现是我们的冰箱的温控出了问题实验际温度要比设定温度低至少4度（呵呵，不好意思！
）。
不过我接着往下进行SDS-PAGE、层析等发现没有什么不良影响。
所以，你不用担心也许你的蛋白也只是和你开了个玩笑呢！
三、关于包涵体的溶解：
1、
请教GST包涵体溶解
直接用8M的脲或
6M胍融解，取上清，测浓度。
直接稀释后包被检测相应抗体。
（由于快速稀释相当于复性过程，产物用于检测没有问题的）
我所用的包涵体提取方法：
1．PBS或生理盐水洗涤诱导后菌体，Buffer
A重悬菌体，超声波破碎至清亮
２．４度，１００００rpm离心１０分钟，
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