高放液相色谱法Word格式.docx

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这种色谱技术称为高效液相色谱法。

和经典柱色谱法相比，具有以下特点：

1．高压流动相经色谱柱时，受到的阻力较大，为了使流动相能迅速地通过色谱柱，必须施加高压。

一般可达150一300kg／cm2。

2．高速使用无脉动的高压泵、流动相的流速一船为1—10m1／min，使样本的分离速度从过去几小时或几天，提高到几分钟或几十分钟。

3．高效使用颗粒均匀的新型细粒固定相，提高了分离效率，一般注效可达50000塔板／m以上，有时一根柱子可同时分离100种以上的组分。

4．高灵敏度应用各种高灵敏度的检测器，可测定微量组分。

使用紫外检测器，最小检测量可达l×

10—9g。

5．高度自动化利用微处理机控制色谱操作条件和处理色谱数据，实现了高度自动化。

6．流出组分容易收集高效液相色谱法和气相色谱法都是重要的分离分析方法，它们在许多方面是相同和相似的，但也存在着差异。

它们的应用领域不同。

在已知的化合物中，只有20％可用气相色谱测定，而液相色谱法可检测的对象占有机物总数的80％一85％；

气相色谱法局限于易挥发和热稳定农药的分离和分析；

高效液相色谱可分离和分折不挥发的，热稳定性差的以及离子型的农药，而且样本前处理简便。

70年代至80年代初期、农药分析大多采用气相色谱法，因为气相色谱法对样本分离快、灵敏和方便，且大多数实验室已完善地配备了气相色谱仪和操作人员。

目前液相色谱技术迅速发展，它不受样品挥发性和热稳定的限制，绝大多数农药都可以使用液相色谱法进行定量分析，而且液相色谱技术在分析中的主要障碍——检测器的灵敏度，在农药常量分析中是不重要的，因为农药制剂中有效成分含量通常是百分之几。

多数农药分子结构中有吸收紫外光的基因，对那些难于用气相色谱测定的农药，可以简便地使用带有紫外检测器的液相色谱法。

测定样本时，使用定量的进样环和自动进样器，其精密度可以达到使用内标的气相色谱法。

国际农药分析协作委员会（CIPAC）出版发行的CIPAC农药分析手册共有I、IA、IB、IC和D五卷。

1985年出版的IC卷和气相色谱法约26个，液相色谱法约有20个；

1988年出版的D卷中36个农药原药和制剂的有效成分含量分析方法中，气相色谱法有16个，液相色谱法有17个；

1989年5月CIPAC第33届年会上讨论通过10个农药分析方法，其中就有乐果、磷胺、久效磷、保棉磷、碘苯腈和大隆等6个农药采用液相色谱法。

从以上统计数字看：

日前液相色谱法在农药分析中已和气相色谱法的数量相当，通常使用一种方法测定后，可以用另一种方法来签定，两种方法在常量分析中可以具有相同的准确度和精密度。

随着液相色谱技术的发展和普及，更多的农药将会使用液相色谱法进行分析。

此外，高效液相色谱法和气相色谱法使用的流动相不同，亦存在以下差别：

（1）气相色谱法的分离是基于混合组分在固定液中的溶解度不同，使用的流动相通常是惰性气体，由检测器的类型来决定，不论使用氢气、氦气或氮气，其作用只是运载样本组分通过色谱柱后进入检测器，而对色谱分离的影响一般很小，即仅有固定相对样本分子中各组分的选择性，因此气相色谱主要是通过改变固定相和改变柱温来改善分离效果。

而液相色谱的流动相为液体，它对样本具有一定溶解性能，除了运载样本组分通过色谱住和进入检测器外，还参与色谱分离过程；

在液相色谱中除通过改变固定相改善分离效果外，通常用改变流动相组成来改善分离，流动相组成可以灵活改变，使用的流动相不同可得到完全不同的分离。

（2）液相色谱的柱温受流动相沸点的限制，通常在室温或略高于室温的条件下测定，分离时温度较低是它的优点，能保留农药的原来分子。

根据这一原理的制备色谱，可用于制备农药标准品。

（3）农药分子在液体中的扩散系数比在气体中小4—5个数量级，所以在高效液相色谱中必须特别注意柱外效应对分离的不良彤响。

（4）液体的粘度比气体的粘度大2—3个数量级，所以液相色谱的柱长通常不超过30cm，而气相色谱可采用长柱，填充柱的长度为0.5—3m，空心柱柱长可达几十米。

（5）液体是不可压缩的，而气体可被压缩，因此在气相色谱中与载气体积有关的参数都必须进行校正。

本章将讨论高效液相色谱的基本理论，色谱分离类型、流动相、检测器及其在农药分析中的应用。

二、基本原理

高效液相色谱的基本理论可参阅有关书籍，它是在经典液相色谱的基础上，引入了气相色谱的理论，加以改进而发展的。

本书不再介绍与气相色谱有关的基本理论。

使用液相色谱的最终日的是要求在最短时间内，使样本获得最好的分离和分析，因此分离度是最主要的。

本节将从基本理论上探讨如何在最少的时间内获得最好的分离。

（一）选择性（分离因子）

色谱柱的选择性是衡量二个化合物能否分离的指标，亦称分离因子。

它是两个组分净保留时间的比（即相对保留值）或两个组分的平衡分配之比。

V——保留体积；

t——保留时间；

W——为峰宽；

h——为峰高

根据图5－1的两个峰，选择性可用下式表示：

（5－1）

t0为溶剂保留时间，t1和t2为峰1和峰2的保留时间，式中kl和k2是农药1和2的分配系数。

（5－2）

（二）容量因子

某一特定化合物在色谱柱上的容量因子是衡量该柱对此化合物的保留特性，是化合物的保留体积与死体积之比，根据图5—1，峰1的容量因子为：

（5－3）

可改写为

（5－4）

因此，一个化合物的容量因子亦是该化合物的净保留时间与非滞留时间之比。

（三）柱效

柱效是衡量某一特定色谱柱对化合物的谱带展宽度和改善分离的能力，用理论塔板数来表示，根据图5—1，理论塔板数（N）可用下式表示：

（5－5）

根据式（5—5），谱带宽度随t成正比地增大，洗脱的谱带宽度增加，高度下降。

因半峰宽易测量准确，计算的N值也比较准确，可用W0.5来表示。

（5－6）

实际计算时，使用理论塔板的相当高度HETP（或H）较方便，它也是柱效率的量度。

（5－7）

L为柱的长度，H小则N大，即柱效高。

在气相色谱中已提及范·

提姆特VanDeemter公式，总结的影响理论板高度的因素为：

H＝A＋B/u＋Cu（5—8）

其中u为流动相的线速度，B／u为纵向分子扩散项，是物质分子由浓度高的区域向浓度低的区域运动。

B＝2vDf，v为一个常数，因此H与扩散系数（Df）成正比，与流动相的线速（u）成反比。

在气相色谱中，气体有较大的扩散系数，而分子在液相色谱中的扩散系数是很小的，比气体中小约4—5个数量级，因此在液相色谱中，纵向扩展的影响是可以忽略不计的，而气相色谱中这一项很重要。

液相色谱中式（5—8）可简化为：

H＝A＋Cu（5—9）

A为涡流扩散项，它表示柱内填充剂的均匀性，颗粒直径和流动相流速等对样品分子所引起的涡流扩散影响，颗粒小而均匀，或组分在流动相中扩散系数大，则涡流扩散小，H亦小，分离效能高，Cu为传质速率项，组分在流动相和固定相中迅速达到平衡，才能形成较窄的谱带，如流动相流速快，组分还未达到平衡就向前移动，物质的非平衡运动，使区带展宽，H加大，颗粒小，固定相层薄，有利于增加柱效，而流速加大是不利的，图（5－2）是理

论塔板高度与流动相流速的关系图。

在气相色谱中，气体分子扩散快，流速影响特别大，H随流速增加而急速下降，达到最低值，为实用最佳流速，当流速再加大时，传质影响起了主要作用，H又加大，在液相色谱中分子扩散比在气相中低l04－105倍，流速低时H不会有很大变化，流速快时对H也影响不大。

在图5—2中，应尽可能使b线的斜率较小，才可不致因流速的提高而使塔板数下降。

（四）分离度

相邻两个峰的分离程度称为分离度R。

两个峰尖之间距离越大，分离度越大；

两峰越宽

则分高度越低。

分离度R按下式计算；

（5－10）

按式（5—10）很容易比较两化合物分离的好坏，但此式不能指导如何改进实验设计，以达到更有效的分离，要求用一些与实验技术有关的参数来表示分离度。

假定相邻两峰的峰宽相等可导出分离度与上述三个基本色谱参数的关系

（5－11）

公式中

（1）项中a是选择性或分离因子，与两组分的峰与峰之间的分离有关。

如a＝l，无论柱的理论塔板数有多大，分离度R等于0。

因此要获得分离，分配系数必须有差别，所以增加a，可使一个谱带的中心相对于另一谱带发生位移。

a是通过变更流动相和固定相组成来改变，固定相不易改变，所以a主要随流动相组成而变化。

当然也可以通过衍生化等改变待测组分的性质。

公式中

（2）项小K’是容量因子，可通过改变溶剂强度来改变。

强溶剂出峰时间短，导致小的K’值，弱溶剂给出较大的K’值，分离度高，但峰变宽；

公式中（3）项中N是理论塔板数，可由改变色谱柱的长度，颗粒的大小，增减流动相的速度而变动。

柱长和保留时间是正比的，柱长加倍，分离所需的时间亦加倍。

最好是通过提高柱填充剂的效能来达到，近年来高效液相色谱发展快，主要是在高效能填充剂方面有很大进展。

图5－3表示不同因子对色谱的影响。

图中（a）分离不良，两峰距离太近；

（b）加大a值后，提高了选择性，两峰分开；

（c）在a的基础上，加大N提高柱效，使峰变窄，峰尖位置不变，但两峰可以分离；

（d）增大K’值，分离度好，但保留时间延长，峰拖尾后谱带变宽。

因此利用式（5—11）使给定的分离最佳化时，首先调整K’值，使K’在2—5之间，诺带不太宽，分离的时间亦合适，其次是选择N，以提高柱效，如分离仍有问题，则可改变a使其具有更大的选择性。

三、装置

高效液相色谱仪的设计与所采用的分离原理无关，可以购买完整的仪器，亦可以购买单

独的部件组装成适用的仪器，典型的液相色谱仪由以下部件组成，贮液器、梯度装置、输液

泵、进样器、色谱柱、检测器，温控部件和记录仪等，其流程图，见图5—4。

（一）贮存容器

某些商品贮液器配备有流动相脱气的装置，装有加热器，温度调节器和磁力搅拌器，流动相的脱气是非常重要的，因为溶剂中溶解的空气在低压部件如检测器里会逸出气泡来，气泡的出现会使检测器的噪声加大。

常用的除气方法有三种：

1）加热法；

2）抽真空法：

3）超声波处理，有时为防止某种溶剂被氧化，可在贮液容器中充满氮气或氦气。

（二）输液泵

在气相色谱中，用高压气瓶来提供一定压力和流速的气体；

波相色谱是用泵来完成。

流动相输送、选择泵系统时应满足以下要求：

1）输液压力高，早期液相色谱的进柱压为60一70kg／cm2，现在液相色谱采用高速高效分离所需的小颗粒和小直径的色谱校，则要求进柱压大到300一500kg／cm2。

2）要求高压下通过性子的液流是连续而无脉动，流动相的流量的变动不应超过2％，输送的流量范围：

分析型为0－10ml／min，制备型为50—100ml／min。

3）能耐流动相的腐蚀。

4）泵的密封性要好，死体积小，以