高效液相色谱法测定虎杖中白藜芦醇的含量.docx
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高效液相色谱法测定虎杖中白藜芦醇的含量
反相高效液相色谱法测定虎杖中白藜芦醇的含量
白祖海，文刚，张艳
（长沙市疾病预防控制中心，长沙410001）
摘要：
采用HPLC法测定虎杖中白藜芦醇含量。
以聚酰胺柱对样品进行预处理，排除其它成分的干扰，获得较好分离度和高回收率。
选用自填装ODS-C18色谱柱（200mm×4.6mm，5μm），以乙醇-水（2：
3,v/v）作流动相，流速为0.6ml/min，紫外光检测波长304nm，柱温为25℃。
白藜芦酵在0.05-0.40μg/mL范围内具有良好的线性关系。
r=0.9996，平均回收率为98.51%（n=5）。
结论：
该方法简便、准确可靠，适合于中药材虎杖中白藜芦醇含量的测定。
关键词：
白藜芦醇；虎杖；反相高效液相色谱法
DeterminationofResveratrolinthePolygonumCuspidatumbyReversed-PhaseHPLC
BAIZu-hai,WENGang,ZHANGYan
（ChangshaMunicipalCenterforPreventionandControlofDiseases,Changsha410001,China）
Abstract：
AsimpleandsensitiveReversed-PhaseHPLCmethodforthedeterminationofresveratrolintherootsofPolygonumcuspidatumwasdescribed，includingthepretreatmentofsamplesbypoamidecolutah.TheseparationwasperformedonanODScolumn（200mm×4.6mm，5μm），withthemobilephaseofCH3CH2OH-H2O（2：
3,v/v）.Theflowrate0.6ml/minandthedetectionwavelengthwas304nm，thetemperatureofthepillarisindoortemperature.Resveratrolhavegoodlinearrelationshipintherangeof0.05-0.40μg（r=0.9996）.Theaveragerecoveries（n=5）ofresveratrolwere98.51%..Asimple，accurateandsensitivemethodwithgoodreproduciabilitytodetermineresveratrolsimultaneouslyinPolygonumcuspidatumSieb.etZucc.isestablished．
Keywords：
Resveratrol；Polygonumcuspidatum；Reversed-PhaseHPLC.
虎杖（PolygonumcuspidatumSieb.etZucc）是蓼科蓼属植物，广泛分布于华东、中南、辽陕甘川滇等地。
虎杖根茎中主要含有蒽醌类和芪类化合物，其中芪类成
收稿日期：
2011-09-28
修订日期：
2012-07-20
作者简介：
白祖海（1978—），男，湖南岳阳人，长沙市疾病预防控制中心，主管检验师，硕士学位
分白藜芦醇（resveratro1）和白藜芦醇苷（piceid），具有活血定痛、清热利湿、止咳化痰作用[1]。
白藜芦醇具有抗氧化、抗癌、抗血小板凝聚、抗菌、调节脂类代谢、保护心血管系统和神经系统等多种功能[2]，被列为抗心血管病、抗癌最有前途的药物之一。
虎杖中白藜芦醇含量最高[3]。
目前对白藜芦醇的测定方法不少[4,5]，主要有分光光度法[6]、胶束薄层色谱法[7]、电化学发光法[8]、高速逆流色谱法[8-9]、高效液相色谱法[10-11]等。
建立准确可靠和简便的测定虎杖中白藜芦醇的含量方法对于虎杖资源的充分开发利用产生重要的实际意义，为其研究开发提供科学的依据。
本研究对虎杖样品进行初步处理，以乙醇-水为流动相，建立了测定虎杖中白藜芦醇的反相高效液相色谱方法，该测定方法操作简单，测定结果稳定可靠。
1实验部分
1.1仪器与试剂
HLPCPump装柱机（BT3020，德国）；高效液相色谱仪（安捷伦，1200系列，美国），RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；WF-4000微波系统（上海屹尧分析仪器有限公司）；高频数控超声波发生器（KQ－80TDB型,昆山市超声仪器有限公司）,FA2104型电子天平。
乙醇（色谱纯，湖南师大试剂厂）；乙醇（化学纯，湖南师大试剂厂）；乙酸乙酯（分析纯，和氏璧化工）；白藜芦醇对照品（美国Sigma公司，纯度99％）；虎杖药材购自湖南九芝堂药材公司。
1.2溶液的制备
1.2.1对照品溶液的配制
称取白藜芦醇2.5mg，置25ml容量瓶中，乙醇溶解，并稀释至刻度。
摇匀，得含白藜芦醇0.10mg/ml的混合对照品储备液，冷藏备用。
1.2.2虎杖的预处理
根据虎杖中自藜芦醇、白藜芦醇苷和大黄素的结构和性质的差异，采用乙醇溶液超声提取，利用极性适中的乙酸乙酯再提取，三种组分的回收率比较高。
提取结果表明：
采用乙醇超声初提取和乙酸乙酯二次提取比单独采用乙醇浸提或回流提取的回收率高。
如最后采用氯仿提取，乳化现象较严重，且结果与乙酸乙酯提取相比较差。
可以同时测定白藜芦醇、白藜芦醇苷和大黄素的含量，并防止白藜芦醇苷水解。
1.2.3样品溶液的制备
本实验采用常规的加热回流方法提取白藜芦醇来建立标准曲线：
虎杖粉末过40目筛，精密称取虎杖粉末50g，用95%乙醇水浴回流提取三次，第一次用250ml乙醇回流提取3h，第二、三次分别用200ml乙醇回流提取各lh，合并提取液,冷却,过滤,滤液减压浓缩至月50ml后加蒸馏水200ml，水浴挥发去残余乙醇，保温30min后过滤。
滤液上聚酰胺柱，大量蒸馏水冲至无色后，用l0%乙醇冲洗，待颜色冲淡后用30%乙醇冲洗，收集30%乙醇冲洗液，减压蒸馏浓缩并定容于100ml容量瓶中，精密吸取上述溶液lml，置10ml容量瓶中，乙醇稀释至刻度。
为了对比常规的加热回流方法提取白藜芦醇提取率的不同，本文还采用微波法来提取白藜芦醇：
虎杖粉末预处理后过40目筛，精密称取虎杖粉末50g，用95%乙醇浸泡1h后，在功率600W下微波处理5次，每次1min，间歇时间为2min，使提取温度不超过30oC。
微波处理后余下的步骤与加热回流方法一致。
图1白藜芦醇对照品和样品液相色谱图
Fig.1HPLCchromatogramsforstandardresveratrolandextraction
solutionofPolygonumcuspidatum
2结果与讨论
2.1色谱条件
色谱柱：
选用ODS-C18色谱柱（200mm×4.6mm，5μm）；流动相：
乙醇-水（2:
3，v/v）；流速：
0.6ml·min-1；检测波长：
304nm；柱温为室温；进样量l0μl。
在此条件下，作白藜芦醇对照品色谱图。
样品溶液以相同条件进样，根据对照品白藜芦醇的保留时间初步确定样品溶液中白藜芦醇的特征峰。
白藜芦醇的出峰时间为3.05min，与其他组分的色谱峰可以达到基线分离。
此条件下白藜芦醇的理论塔板数均不低于3000。
对照品及样品液相色谱图见图1。
2.2标准曲线的绘制
精密吸取混合对照品储备液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml，置10ml容量瓶中，乙醇稀释至刻度，制成不同浓度的混合对照品溶液。
按“2.2色谱条件”测定峰面积积分值，以峰面积积分值Y为纵坐标，对照品进样量X为横坐标绘制标准曲线，进行线性回归，计算回归方程。
白藜芦醇的线性回归方程及相关系数为：
Y=9.464×10-5X+0.225
式中，X为白藜芦酸质量浓度，单位为μg/mL；Y为色谱峰面积，单位为mm2，线性回归系数r=0.9996，最小检出限为10ng/mL。
试验结果表明，白藜芦醇在0.05-0.40μg/ml范围内呈良好的线性关系。
2.3虎杖中白藜芦醇含量测定
对同一批药材精密称取5份，按2.1溶液配制方法制备样品溶液。
将制备好的待测溶液按上述色谱条件进样，根据峰面积计算该样品溶液中白藜芦醇的含量。
计算公式为n=（a/b）×100%。
其中n为白藜芦醇的含量（g）；a为白藜芦醇质量（g）；b为虎杖粗粉的质量（g）。
计算平均值得到虎杖中白藜芦醇的含量为0.3500%（见表1）。
表1虎杖中白藜芦醇含量的测定
Tab.1DeterminationofResveratrolinthePolygonumCuspidatum
序号
加入量（g）
白藜芦醇（%）
1
20.0025
0.3501
2
20.0472
0.3496
3
20.0365
0.3502
4
19.9894
0.3498
5
20.0148
0.3504
2.4加样加标回收试验
依次配制白藜芦醇对照品溶液、样品溶液和样品加对照品溶液，按上述方法测定其含量。
将所得的5份供试品溶液按“色谱条件”项下进行测定，每份样品测定5次，计算加样回收率。
测得平均回收率为98.51%；相对误差（RSD）为0.2279%，回收效果很好（见表2）。
表2回收率试验结果
Tab.2Resultofrecoveryratio
序号
加入量（μg）
测得量（μg）
回收率
（%）
平均
回收率
相对误差
1
3.20
3.16
98.75
98.51%
0.2279%
2
7.40
7.31
98.78
3
11.20
11.03
98.48
4
16.20
15.97
98.58
5
22.80
22.34
97.98
2.5重复性试验
精密称取样品5份，按上述方法制备样品溶液和做液相色谱检测，计算5个样品中虎杖中白藜芦醇的平均含量为0.3506%，相对误差RSD为2.56%。
实验结果见表3。
可以看出，检测结果表现出很好的重复性，实验误差在允许范围内。
据此认为可将此法用于实际样品分析。
表3重复性试验结果
Tab.3Resultsofrepeatabilitytest
序号
加入量（g）
白藜芦醇（%）
相对误差（RSD）
1
20.0236
0.3485
2.560%
2
20.0325
0.3548
3
19.9897
0.3493
4
20.0048
0.3509
5
20.0042
0.3495
2.6稳定性试验及提取方法的影响
2.6.1对同一供试品溶液在8h之内每隔1h测定峰面积，试验结果表明。
白藜芦醇色谱峰面积无明显变化，其峰面积积分值的相对误差RSD分别为1.196％,表明样品的溶液稳定性很好。
2.6.2由于白藜芦醇对光热较敏感易分解，用常规法提取时活性受影响，且提取率低，故采用微波提取法。
微波提取是近年才发展起来的一项新技术，与常规
提取相比，其最大特点是作用时间短、速度快、提取效率高、提取温度低（<45℃）。
微波用于虎杖白藜芦醇的提取，可最大限度地避免提取过程中受光、热影响而分解，提取率大大提高。
本实验在加热回流办法建立标准曲线的基础上，采用微波提取法来提取白藜芦醇，来对比其与常规浸提法对白藜芦醇提取率的影响。
表4为常规
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