EB病毒核酸检测试剂技术审查指导原则文档格式.docx

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三、注册申报资料要求

（一）综述资料

综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及同类产品上市情况介绍等内容，其中同类产品上市情况介绍部分应着重从方法学及不同型别检出能力等方面写明拟申报产品与目前市场上已获批准的同类产品之间的主要区别。

对于本类申报产品，应着重从样本类型、样本采集与制备方式、目标基因片段的选择、方法学特征等方面描述。

（二）主要原材料的研究资料

此类产品的主要原材料应包括EB病毒检测试剂的所有主要组成成分，如引物、探针、酶、反应缓冲液、提取成分等。

如为申请人自行研制的主要原材料，申请人应对EB病毒目的基因序列确定、引物和探针选择、酶的选择和验证等实验过程予以详述；

并提供对各主要原材料的性能研究资料，如:

外观、纯度、蛋白浓度、功能性研究等。

制备完成的原料成品应进行质量检验以确认其符合标准要求，整个生产工艺应稳定可控。

如为申请人外购主要原材料，应详述每一原材料外购方来源，提交外购方出具的原材料性能指标及质量控制资料，并详述申请人对外购主要原材料的各指标质量要求以及确定该原材料作为本产品主要原材料的详细依据。

1.核酸分离/纯化组分（如有）的主要组成、原理介绍及相关的验证资料。

2.PCR组分的主要原料（包括引物、探针、各种酶及其他主要原料）的选择、制备、质量标准及实验研究资料，主要包括以下内容：

2.1脱氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的组成成分，包括：

dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP；

应提交对其纯度、浓度、保存稳定性等的验证资料。

2.2引物

由一定数量的dNTP构成的特定序列，通常采用DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化，并对序列准确性、纯度、稳定性、功能性实验等的验证。

如为外购，应提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）结果或高效液相色谱法（HPLC）分析图谱。

2.3探针

特定的带有示踪物（标记物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能与互补核酸序列退火杂交，用于特定核酸序列的探测。

合成后经PAGE或其他适宜方法纯化，在5'

-端（和/或3'

-端）进行标记，并经HPLC或其他适宜方法纯化，纯度应达到HPLC纯。

应提供合成机构出具的合成产物质检证明，如HPLC分析图谱，应对探针的分子量、纯度及标记的荧光基团进行核实，并进行功能性试验验证。

2.4酶

DNA聚合酶，应具有DNA聚合酶活性，无核酸内切酶活性，具热稳定性，如：

94℃保温1小时后仍保持50%活性。

尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG），具有水解尿嘧啶糖苷键的活性，无核酸外切酶及核酸内切酶活性。

逆转录酶，具逆转录酶活性，无核酸内切酶活性。

应对酶活性进行合理验证。

3.核酸类检测试剂的包装材料和耗材应无脱氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染。

4.企业内部参考品：

企业内部参考品是保证产品性能稳定性以及检测值可溯源的重要构成之一。

参考品研究应包括原料选择、制备过程、定值研究、评价指标、统计学分析等。

建议采用灭活病毒的临床样本或培养后的病毒株建立参考品，并溯源至国际参考物质，不宜使用质粒。

内标设置应合理，质控品宜采用混合临床样本或病毒株或假病毒制备。

内对照（内标）以对管内抑制可能造成的假阴性结果进行质控。

申请人应对内标的引物、探针和模板的浓度做精确验证，保证内标荧光通道呈明显的阳性曲线，不应对目的基因的检测造成竞争性抑制而导致假阴性，对内标的Ct应有明确的范围要求。

质控品应参与样本核酸的平行提取，以对整个PCR反应过程、试剂/设备、交叉污染等环节进行合理质量控制。

企业应对各种质控品的Ct做出明确的范围要求。

企业应提交详细的溯源性研究资料。

企业制备的企业内部参考品、用于制备商品化校准品的储备液均应能够溯源至国际参考品。

（三）主要生产工艺及反应体系的研究资料

基本生产工艺主要包括：

配制工作液、半成品检定、分装和包装。

配制工作液的各种原材料及其配比应符合要求，原材料应混合均匀，配制过程应对pH、电导率等关键参数进行有效控制。

生产工艺研究的资料应能对反应体系涉及到的基本内容，如样本类型、样本用量、试剂用量、反应条件、校准方法、质控方法、稳定性和有效期，提供确切的依据，主要包括以下内容：

1.主要生产工艺介绍，可以图表方式表示。

2.DNA提取纯化方法优化，建议包含纯化步骤，内标、质控品均应全程参与提取纯化。

3.确定最佳PCR反应体系的研究资料，包括酶浓度、引物/探针浓度、dNTP浓度、阳离子浓度、样本量、加样量及反应体积等。

4.确定PCR各阶段温度、时间及循环数的研究资料。

5.对于基线阈值（threshold）和阈值循环数（Ct）确定的研究资料。

6.不同适用机型的反应条件的对比分析，如果有差异应分别详述。

（四）分析性能研究资料

申请人应提交生产者在产品研制或成品验证阶段对试剂盒进行的所有性能验证的研究资料，对于每项分析性能的评价都应包括具体研究目的、实验设计、研究方法、可接受标准、实验数据、统计方法等详细资料。

有关分析性能验证的背景信息也应在申报资料中有所体现，包括实验地点（实验室）、适用仪器、试剂规格、批号、临床样本来源等。

分析性能评价的实验方法可以参考相关的美国临床实验室标准化协会批准指南（CLSI-EP）文件或国内有关体外诊断产品性能评估的指导原则进行,建议着重对以下分析性能进行研究。

1.EBDNA提取

病毒DNA提取主要有以下目的：

富集目的基因浓度、保证目的基因序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，是决定PCR成败的关键环节。

因此，无论申报产品是否含有DNA分离/纯化的组分，企业都应对核酸提取的环节做详细的验证。

临床标本中可能含有各式各样的PCR抑制物，因此，对于DNA提取试剂的选择，除最大量分离出目的DNA外，还应有纯化步骤，尽可能去除PCR抑制物。

目前常见的DNA分离纯化方法和改良方法各有优势和不足，申请人应结合申报产品的特性，合理选择DNA分离/纯化试剂，并提供详细的验证资料（提取效率、与后续试验的配合等）。

2.最低检出限与定量限（分析灵敏度）

（1）最低检出限与定量限的确定

建议使用国际参考品进行梯度稀释并多次检测，将具有95%以上阳性检出率的病毒水平作为最低检出限。

定量限应高于或等于检出限，将多次（至少10次）测量的结果符合试剂准确度要求的最低病毒水平作为定量限。

（2）最低检出限和定量限的验证

申报试剂应在最低检出限或接近最低检出限、定量限的病毒浓度进行验证。

企业应能够提供用于最低检出限/定量限验证的病毒株的来源、及浓度确认试验等信息。

不同样本类型（如涉及），应分别评价最低检出限及定量限。

3.线性范围

线性范围确定的研究应使用高值临床样本或病毒株按一定浓度加入血液基质中（由可溯源至国际参考品的方法定量）进行梯度稀释，稀释液应使用经确认为阴性的混合人血液样本，应包含不少于9个浓度（应包含接近最低检测限的临界值浓度），使用至少3个批次的试剂进行试验。

通过评价一定范围内的线性关系及各水平的准确度确定该产品的线性范围。

不同样本类型（如涉及），应分别评价线性范围。

4.准确度

应使用国际参考物质或企业内部参考品和临床样本进行阳性/阴性符合率或者方法学比对研究。

5.精密度

应对可能影响检测精密度的主要变量进行验证，评估重复性和重现性，包括运行内的变异和运行间、日内、日间、批次间、操作者间、仪器间和地点间的变异。

建议设定合理的精密度评价周期，例如为期12天的检测，每天由2人完成不少于2次的完整检测，注意应包括核酸分离/纯化步骤。

可采用临床样本进行试验，至少包含3个浓度水平：

阴性样本、略高于最低检测限的弱阳性样本、中等阳性样本。

6.特异性

（1）交叉反应

用于EBDNA检测试剂交叉反应验证的病原体种类主要考虑以下几方面可能性：

核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状（推荐种类见表1）。

建议在病毒和细菌感染的医学相关水平进行交叉反应的验证。

通常，细菌感染的水平为106cfu/ml或更高，病毒为105pfu/ml或更高。

申请人应提供所有用于交叉反应验证的病毒和细菌的来源、种属/型别和浓度确认等试验资料。

有关交叉反应验证的信息应以列表的方式在产品说明书的【产品性能指标】项中有所体现。

表1用于交叉反应研究的微生物（推荐）

微生物

水痘-带状疱疹病毒

人类免疫缺陷病毒*

乙型肝炎病毒

梅毒*

巨细胞病毒

人疱疹病毒6型

人疱疹病毒7型

人疱疹病毒8型

单纯疱疹病毒1型

单纯疱疹病毒2型

甲型流感病毒*

金黄色葡萄球菌

白色念珠菌

腺病毒*

*为可选验证的交叉反应病原体。

（2）干扰物质

应针对不同样本类型，分别评价可能存在的干扰情况。

建议在每种干扰物质的潜在最大浓度（“最差条件”）进行评价，并在待测物的医学决定水平进行检测。

潜在的干扰物质包括内源性、外源性和其他已报道的干扰物质。

样本应至少选取全血（或血红蛋白和白细胞）、人白蛋白、胆红素、甘油三酯、系统性红斑狼疮患者血、抗核抗体、类风湿因子等进行验证，并注明对被测物不产生干扰的最高限值。

7.其他需注意问题

对于适用多个机型的产品，应提供如产品说明书【适用机型】项中所列的所有型号仪器的性能评估资料。

如适用于不同样本类型，应提交对不同样本类型一致性的验证，包括不同抗凝剂、采血管（如涉及）的验证。

（五）阳性判断值研究资料

申请人应考虑不同地理区域流行病学背景以及人口统计学特征（包括性别、地域、种族等因素）的差异，选择具有代表性的样本建立阳性判断值，注意应纳入一定数量的弱阳性样本。

建议申请人从临床意义的角度出发，合理设定灰区范围并详细说明确定的依据，并提供灰区的确定资料。

如采用其他研究方法，应说明其合理性。

对于荧光实时PCR方法即为用于结果判读的Ct值的确定资料，包括确定基线阈值（threshold）和阈值循环数（Ct）的研究资料等。

另外，建议申请人考虑建立阳性判断值时使用的受试者样本对于目标人群