CB-G造血干细胞维持衰老与再生的调控机制研究_精品文档Word文档下载推荐.doc

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通过对HSC发育、维持、衰老及再生调控机制的研究,在理论上阐释组织干细胞在机体衰老和再生修复中的重要的生物学基础；

在技术方法上为其它组织干细胞研究引领新的方向，提供新的分子靶点及可以借鉴的新方法新技术；

在应用策略上将探索HSC及iPS细胞在体外高效、安全的扩增与定向分化的新策略。

最终促使我国在干细胞特别是HSC调控研究领域达到国际领先水平，形成自己的特色和亮点。

同时，以本项目为纽带，促进多学科、多院校的合作和交流，大力扶持和使用青年科技骨干，造就出一批优秀的干细胞研究人才。

五年预期目标：

1、利用本团队已建立的小鼠模型，通过对p53-p21途径和p16-pRb途径等HSC维持的内在调控机制及成骨细胞、MSC及其分泌因子等HSC外在调控的机制的研究，阐释HSC维持的内、外调控机制及完整网络，并从关键分子及机制入手，为对抗骨髓衰竭和促进再生策略的研究提供理论基础。

2、利用端粒酶、ATM和GADD45a基因敲除小鼠模型，研究衰老和损伤应激状态下HSC端粒缩短和内源性ROS升高的原因，阐释HSC衰老的内外调控机制，重点研究引起HSC衰老的关键分子信号通路及其调控机制，为抗衰老研究策略提供理论基础。

3、应用斑马鱼和小鼠等模式生物，筛选出2-6个参与HSC发育调控的关键“节点”基因；

明确若干HSC维持和衰老的重要调控分子在HSC发育中的作用；

通过制备具有体内示踪功能的新型模式小鼠，阐明不同位点对造血系统发育的生理性贡献。

4、探讨不同衰老程度的HSC与iPS细胞生成的关系，阐明衰老对HSC重编程能力及所产生的iPS细胞多能性的影响；

对iPS细胞向造血细胞分化的机制进行探讨，从而优化诱导分化条件，提出基于iPS细胞的HSC再生新策略。

5、取得具有国际影响的原创性成果,预期在国内外专业期刊上发表高水平论文，其中在国际一流学术刊物（IF>

10）上发表论文15篇以上，在有影响力的杂志（IF>

5）上发表论文30篇以上。

申请专利15项以上。

6、预计培养博士后15-20人，博士研究生30-50人及一批学术水平高、创新能力强的中青年学术骨干,为造血干细胞研究成立一支具有国际影响力的高水平研究队伍。

三、研究方案

（一）学术思路：

正常HSC的稳态维持、自我更新与分化是一个复杂的生理现象，由内源性调控机制及外源性调控机制所共同形成的的调控网络在HSC的稳态维持、自我更新及定向分化的过程中发挥重要作用。

在综合本团队及国外的最新研究进展的基础上，我们将以HSC的发育、维持、衰老及再生为研究的主线，以内在调控机制和HSC微环境作为两个重要的切入点，通过正向遗传学及iPS细胞反向来源的HSC两条途径，对正常及衰老状态下调控HSC命运的关键环节特别是关键分子靶点及网络进行系统和全面的研究，并利用发育生物学的方法和技术加以验证和补充。

其中正常及衰老状态下HSC的维持与自我更新的调控机制是整个研究的核心和重点，将系统完整地阐释HSC稳态及衰老的整体调控网络和关键的分子基础。

而对HSC的发育调控机制的研究，可以为整个调控网络的阐述提供重要的分子靶点及调控通路，弥补细胞水平上研究的不足，最终阐明HSC衰老与再生的整体调控网络及关键分子基础。

在上述研究的基础上，从调控HSC维持与分化的各个环节，对正常HSC及iPS细胞在体外扩增及诱导分化的调控机制及策略进行深入研究，服务于抗衰老及促进组织再生的总目标。

（二）技术途径：

根据以上学术思路，以HSC的稳态维持、衰老与再生的调控机制这一关键问题为出发点，从内源性调控机制及外源性调控机制两个方面，通过正向遗传学及iPS反向来源的HSC两条通路，利用关键模式动物，在分子水平上以p53-p21和p16-pRb两条信号通路为核心，在细胞水平上以细胞周期调控及端粒为切入点，分别从成体HSC稳态维持的内外调控机制；

HSC衰老的关键分子及调控机制；

HSC发育的调控机制；

iPS为基础的HSC再生新策略四个方面阐述HSC发育、维持、衰老及再生的完整调控网络及分子机制。

上述四个方面的研究技术途径如下所示：

1、成体HSC稳态维持的内外调控机制

技术流程图：

如图所示对HSC稳态维持的内（p53通路和p16-pRb途径）、外（成骨细胞、MSC等造血干细胞微环境组成成分及其分泌因子）对HSC的稳态维持的调控作用机制。

具体方法如下：

A．动物模型（单基因敲除、双基因敲除小鼠）的建立及繁育

B．分离不同月龄模型小鼠的HSC后，研究HSC/HPC细胞周期的特点，并从细胞周期调控蛋白的表达水平、功能等方面分析该模型HSC细胞周期调控的机制与特点。

C．利用流式细胞术分析HSC/HPC的免疫表型

D．利用体外HSC的长周期培养、单细胞培养实验及体内重建造血实验、骨髓竞争移植实验等评价模型小鼠的HSC及其干细胞巢的功能。

E．用基因芯片比较基因单敲除、双敲除小鼠及基因过表达小鼠和正常小鼠HSC基因表达的差异，并用实时定量PCR加以验证。

根据实验得到的结果，选择1－2个目的基因进行干预，观察对HSC数目及功能的影响。

2、HSC衰老的关键分子及调控机制

技术路线：

如图所示，课题研究的主要技术途径是以HSC衰老的两个关键分子信号通路为核心，即端粒依赖的p53-p21途径和端粒非依赖的p16-pRb途径。

Terc-/-小鼠的HSC在衰老过程中端粒持续缩短，通过激活p53-p21途径引起HSC的衰老。

另外，ATM-/-小鼠的HSC中内源性ROS升高，激活p38依赖的p16衰老途径，导致HSC的自我更新能力下降。

GADD45a基因在维持基因组的稳定性、细胞周期调控、DNA修复、调控细胞衰老及凋亡等方面起着重要作用。

当细胞受到各种损伤应激时，在p53或者p38介导下，GADD45a直接参与细胞周期的调控。

课题的第一部分主要研究端粒缩短或者ROS升高是否通过GADD45a基因调控HSC的自我更新和稳态维持。

动物实验发现，放射线照射引起HSC中慢性氧化应激导致HSC衰老，其中NOX4是介导HSC中ROS升高的重要原因。

课题的第二部分主要探讨端粒缩短或者ATM基因缺失是否通过NOX4基因上调HSC内源性ROS水平。

3、HSC发育的调控机制

如图所示，本课题首先通过斑马鱼和小鼠2种手段发掘潜在的调节分子。

通过对已有的HSC发育突变家系进行定位克隆，识别2-6个关键“节点”基因；

或者，建立Flk-1p/e报告载体，利用小鼠体内和体外细胞模型分别筛选与内皮细胞造血功能有关的调控分子。

继而，从发育新位点、起源模式及表面分子特征3个方面研究小鼠胚胎HSC的发育特点，应用T/B细胞体外诱导分化、HSC移植等手段；

采用胚胎发育中仅在特定内皮细胞群体中表达的分子如Endomucin和EphB4的启动子，构建组成型或可诱导型的在特定内皮细胞中表达Cre重组酶的转基因小鼠，进一步实现谱系示踪，了解这些特定的内皮群体生理条件下对HSC的贡献，并为实现生血内皮水平的特定基因敲除奠定基础。

最后，基于已有的基因敲除小鼠；

或者选取前述筛选获得的若干候选基因，应用小鼠胚胎干细胞和胚胎AGM区细胞的基因过表达/敲减、以及基因敲除小鼠等技术手段，通过分析造血相关基因表达、不同造血前体（血液血管干细胞、生血内皮细胞、HSC）的数量及功能评价它们在小鼠胚胎造血发育中的重要意义。

4、iPS细胞为基础的HSC再生新策略

如图所示:

从不同年龄段的人外周血或骨髓中获得HSC，分析HSC中p53,p16以及DNA甲基化等特征。

并诱导其重编程为iPS细胞，进行表型与全能性鉴定，在此基础上比较不同年龄段HSC生成iPS细胞能力是否不同。

进一步以不同来源iPS细胞为起始细胞，定向诱导其向造血细胞乃至红系细胞分化，比较不同来源的iPS细胞向造血细胞分化的能力。

与此同时，对iPS细胞向HSC尤其是红系祖细胞定向分化的机制进行探讨，侧重研究Wnt3a、PGE2等分子的调控作用。

（三）创新点与特色

1、首次研究p53、Rb和端粒等重要信号通路中的关键分子环节中Puma、GADD45a、p21、p18、ATF4和NOX4等一系列重要相关分子在组织干细胞稳态维持和衰老中的独特作用及其相互关系,并进一步利用发育模式生物寻找若干新的与组织再生紧密相关的分子靶点。

因而本项目的科学问题具体明确，有很强的创新性。

２、围绕HSC的调控这一重点，以其内在机制和微环境作为两个重要的切入点，通过正向遗传学及iPS细胞反向来源的HSC两条技术路经，在国家重大研究计划中第一次对调控HSC命运的网络及关键分子靶点进行系统和全面的研究，从而弥补我国在此领域的空白。

3、鉴于HSC是研究历史长、表型较清楚、最早报道与整体衰老相关且临床治疗效果得以公认的一类组织干细胞，研究结果不仅对研究其它组织干细胞在机体衰老再生中的作用有着无法取代的范式作用，而且具有直接的临床指导价值。

因而本项目研究重点十分突出和必要，有很大的潜在社会效益。

4、参加人员已在相关领域已得到国际认可或领先的前期研究结果。

本研究课题所涉及的各个方面内容大多是在以往工作基础上的进一步延伸或拓展，但又与前期工作无重复。

因而本项目具有很高的研究起点和可行性。

预期结果必将在国际上占领HSC研究领域中的新高地，促进我国干细胞研究整体水平和地位的进一步提升。

5、研究团队整合了目前国内从事HSC生物学和应用基础研究的最优秀的力量。

其中大部分骨干已有成功合作的基础、成果或正在合作，课题设置充分体现青年研究人员的骨干作用，因而本团队是一个有机整合、布局合理、充满活力，有着很强竞争力和创新力的研究队伍。

（四）可行性分析

1、前期工作基础

1）团队内前期取得了大量研究成果，本项目是对这些原创性研究的进一步深化、整合及转化，保证了研究方案的顺利执行及预期目标的实现。

2）团队内已经开展的广泛深入的合作（共同申请了课题及共同发表了相应的高水平的文章）为项目顺利进行奠定了坚实基础，可使各课题间的有机、密切的联系得以实现。

2、学术队伍：

1）高水平的学术带头人保证了项目研究方向的前瞻性、准确性及研究方案的可行性，科学性。

项目推荐首席科学家程涛教授为长江学者特聘教授、国家杰出青年基金获得者、并于2008年任实验血液学国家重点实验室主任。

作为知名的干细胞生物学家，曾在美国作为课题负责人获得多项NIH等机构的基金资助并多次参加NIH干细胞项目评审。

多次领衔天津市干细胞研究重大项目和负责科技部国家级科研项目，掌握干细胞生物学研究的国际动态和发展趋势，多次举办过规模不等的国内外学术研讨会或讲习班，具有较强科研组织协调能力，从而本项目的执行打下必要的基础。

其它课题负责人或是相关研究领域的优秀学科带头人或是在国际上有相当影响力的海外回国人员。

这些特点将有利于保证项目的顺利完成。

2）结构合理的优秀科研团队保证了研究方案的顺利实施：

团队汇集了国内造血干细胞研究领域的领军人物，包括了多名长江学者、国家杰出青年、百人计划、北京市科技新星等优秀科研人才，长期从事HSC生物学方面的研究，尤其在HSC细胞周期调控、p53下游基因、端粒酶、HSC发生、发育及iPS等方面做出了一系列原创性并具有国际领先性的研究工作。

在国际顶尖杂志（Science,Nature,NatureGenetics,NatureMedicine,NatureCellBiology,Cell,CellStemCell,PNAS,Blood,StemCells等）上发表过造血干细胞相关的学术论文50余篇（第一作者及通讯作者），掌握项目实验涉及的全部先进技术，具备良好的