维生素C生产现状及应用研究Word文档格式.docx

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它能增加组织中的环磷腺昔、环磷鸟昔的含量，增强机体的抗病能力和解毒功能，改善肝功能。

Vc还具有降血脂、加速血液凝固、抗组胺和阻止致癌物质亚硝胺生成的作用。

临床上Vc用途很多，可防治坏血病、细菌感染性疾病、病毒感染性疾病、动脉粥样硬化治疗高血压、克山病心源性体克、肝脏疾病、胆绞痛、贫血、特发性血小板减少性紫瘫、过敏性疾病和胶原病、银屑病、氟骨症、肤氨酸尿石症、剥脱性角质松解症、色素沉着、黄褐斑能促进骨折愈合、伤口愈合、防治癌症，还可用于甲亢、精神病、糖尿病等的辅助治疗。

目前Vc已被收入美、英、法、德、日等多国药典和欧洲、国际药典，中国药典1995年版也收载了Vc原料药和片剂，泡腾片、颗粒剂、注射液等四种制剂。

2.2食品中的用途

最近，一些科学家提出了“世纪营养新概念”，过去人们的膳食以预防营养不足为目标，而现在则应以预防疾病、强身建体为出发点。

美国保罗拉勒斯教授说：

由于外界因素，诸如辐射、吸烟、空气污染、过度劳累、微生物感染等原因，人体内部产生的“自由基”越来越多，这就需要富含抗氧化作用和含自由基消除剂的食品来阻止、抑制或结合那些致病因子，削弱自由基对人体的危害。

具体作法是补充更多Vc及Ve等维生素。

在西方国家中，Vc大量添加在各种食品和饮料中，用量很大。

如用于食品保鲜、贮藏、健康食品添加剂，人体营养剂，桔子汁、果冻、果酱的维生素强化剂及油脂的抗氧化等等。

美国1995年消费的Vc中,食品和饮料行业占35%,达到6000吨。

1992年日本Vc消费量的用在食品和饮料行业中，英国等国对饮料、罐头、面粉、面包、葡萄酒、饮料、牛奶制品等产品中添加Vc的量都作了详细规定。

3生产工艺进展

3.1莱氏法

莱氏法是1933年德国化学家Reichstein等发明的最早应用于工业生产VC的方法。

该法以葡萄糖为原料，经催化加氢制取D-山梨醇，然后用醋酸菌发酵生成L-山梨糖，再经酮化和化学氧化，水解后得到2-酮基-L-古洛糖酸（2-KLG）,再经盐酸酸化得到VC。

莱氏法生产的VC产品质量好、收率高。

由于生产原料廉价易得,中间产物的化学性质稳定，至今仍是许多国外VC生产商,如Roche公司、BASF/Takeda公司和E.Merck公司等厂商采用的主要工艺方法。

但是莱氏法也存在不少缺陷,诸如生产工序多、劳动强度较大，使用大量有毒、易燃化学药品，容易造成环境污染等。

为此,自20世纪60年代起,各国学者一直致力于莱氏法的改进。

莱氏法化学合成工艺

莱氏法合成工艺线路

3.2二步发酵法

70年代初，我国首先研究出两步发酵法，其先进性得到世界公认，它是以生物氧化过程代替莱氏路线的部分化学合成过程，进而合成维生素C。

发酵

二步发酵法的生物转化过程如下:

其中，D-山梨醇转化为L-山梨糖是由黑醋酸菌完成的，该工艺在莱氏法中就已使用，由于工艺成熟且生物转化率高（98%以上），因此在二步发酵法中得以延用。

提取工艺

二步发酵法两次发酵以后，发酵液中仅含8%左右的2-KLG，而残留菌丝体、蛋白质、多糖或悬浮微粒等杂质的含量却很高。

这给2-KLG的分离提纯带来了很大困难，致使后处理费用占总成本的比例较大。

目前，V工业生产中常用的2-KLG的分离提纯方法有加热沉淀法、化学凝聚法和超滤法。

①加热沉淀法

加热沉淀法是2-KLG分离提纯的传统工艺，分离手段较为落后。

此工艺通用氢型树脂，调pH至蛋白质的等电点后加热除蛋白。

采用此工艺会造成有效成分在高温下降解损失，且发酵液直接通过树脂柱，造成树脂表面污染，降低树脂的交换容量和收率。

两次通过树脂柱带进了大量水分，也增大了浓缩耗能。

②化学凝聚法

化学凝聚法是通过加入化学絮凝剂来除去蛋白质、菌体、色素等杂质，避免了加热沉淀时有效成分的损失。

季光辉等采用化学凝聚法对VC发酵液进行预处理，使2-KLG的滤液质量提高，提取前步收率提高5.2%，VC总收率提高2.5%以上。

以壳聚糖为主凝剂，聚丙烯酰胺为助凝剂，通过化学凝聚法除蛋白工艺。

提取收率由原来的76%提高到82%，古龙酸优级品率由原来的35%提高到60%,成本比原来降低20%。

但是化学凝聚法也存在许多不足，比如在处理后的发酵液离心后所得的上清液中任然存在一定量的蛋白，如果发酵液染菌则处理效果更不明显，上清液浑浊，严重影响了产品的品质和收率。

此外，化学凝聚法在操作过程中也会对环境造成污染。

③超滤法

超滤是一种新兴的膜处理技术，此法具有操作方便、节能、不造成新的环境污染等优点，因此在2-KLG的分离提纯中的应用日益广泛。

此法与加热沉淀法不同的是，可在常温下操作，可减少有效成分的损失；

在用膜除蛋白的过程中，无任何新的化学物质加入，可减少对树脂的污染和损耗，降低酸碱用量，减少三废排放。

与化学凝聚法不同的是，在处理染菌的发酵液时仍可达到较好的处理效果。

我国的东北制药厂1995年从丹麦引进目前全国最大膜面积的平板超滤装置后，2-KLG的分离提纯成本比原先的化学凝聚法节约了600万元，其收率和生产的自动化、连续化程度也明显提高。

随着新型膜材料技术的开发，如陶瓷膜、不锈钢膜等的应用，超滤法的应用效果会有进一步的提高。

同时,国内外正在探索反渗透、纳滤等后序处理新工艺的应用,以完善工艺联结。

转化工艺

无论是莱氏法还是二步发酵法制得的2-KLG，目前在生产上都是通过化学反应过程转化为VC。

根据所选试剂的不同，二步发酵法可分为酸转化法和碱转化法。

①酸转化法

VC化学转化生产，自莱氏法建立以来就采用浓盐酸催化2-KLG，一步制得VC。

国外有关学者对此法进行了许多研究。

印度AhmedbadTextile工业研究协会研究表明，在以饱和氯代烃（如CHCl3）、芳烃（如苯、甲苯）为溶剂,由2-KLG与浓盐酸在60~75℃下反应4~6h,可制得纯度为90%的粗VC。

美国学者YODICE等于1985年报道了2-KLG与浓盐酸在表面活性剂Me（CH2）5N+Me3Cl的甲苯溶液中反应，可制得纯度超过99%的VC。

酸转化法工艺简单，操作步骤少，但反应过程中选用浓盐酸对设备腐蚀严重。

另外，由于在反应体系中引入了惰性溶剂或表面活性剂，使后期的分离造成不便②碱转化法

我国VC生产厂家均采用碱法转化2-KLG生产VC。

东北制药总厂等生产单位将2-KLG与甲醇在浓硫酸催化下生成2-酮基-L-古龙酸甲酯，该酯在NaHCO3作用下发生内酯化反应生成VC钠盐。

该法避免了酸催化的上述缺点，且操作工艺简单，反应条件温和，适合于规模化生产，但是在生产中的反应周期过长，甲醇单耗高。

有些单位尝试用CH3ONa代替NaHCO3进行碱转化，转化率可高达92.6%，但产品质量较差，且甲醇钠价格贵，造成生产成本较高。

由VC钠盐制备VC所采取的主要方法是硫酸酸化法和树脂交换法。

硫酸酸化法操作简单，但需妥善控制甲醇的浓度和pH值,才能使硫酸钠与VC得以分离。

氢型离子树脂交换法设备庞大，操作复杂，且需经常再生树脂，增加了酸耗，酸液大量排放容易对环境造成威胁。

目前，人们正在积极探索使用双极性膜（BipolarMembraneElectrodialysis，BME）来代替传统的酸化工艺，其工作原理为：

在直流电场作用下，双极性膜中的水被离解成H+和OH-，H+替换VC钠盐中的Na+结合成离解度小的VC,原VC钠盐中的Na+在电场的作用下通过阳离子交换膜从VC钠盐中分离出来,并和OH-结合生成NaOH。

双极性膜电渗析法无需外加物料可将VC钠盐转化成VC，过程简单，能耗低，投资少，转化率高，其副产品和NaOH稀溶液也可被有效利用，对环境无污染，有望应用到实际生产中。

3.3葡萄糖直接发酵法

不能以葡萄糖作为直接发酵原料是二步发酵法的最大缺陷之一。

国外较早就开始了细菌串联发酵葡萄糖产生2-KLG的研究。

Sonoyama研究发现，欧文氏菌的突变株（Erwinia）可将D-葡萄糖氧化成为2，5-二酮基-D-葡萄糖酸,再经棒状杆菌属、短杆菌属、节杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属或葡萄球菌属等其中的某些菌株还原成2-KLG。

考虑若能将欧文氏菌和棒状杆菌相关的特性结合于一种微生物中,构建VC基因工程菌，就可实现从D-葡萄糖到2-KLG的一步发酵。

近年来，基因工程菌的研究已成为世界上热点课题之一，美国、瑞士、法国、日本等许多国家都着力开展了此方面的研究。

1985年，美国Genentech公司Anderson等人成功地分离纯化了棒杆菌（Corynebacteriumsp.）ATCC31090的2，5-DKG还原酶,并分析了该酶N-端的40个氨基酸序列，用原位杂交法从部分基因文库中筛选到一个基因片段，再以已知片段为探针得到了完整基因，最终该基因被重组到了另一株发酵生产菌草生欧文氏菌（E.herbicolaATCC21998）中,得以有效表达,从而实现了从D-葡萄糖到2-KLG的一步发酵。

该法的合成效率很低，只有5%左右，主要是由于合成2，5-DKG的3种关键酶D-3葡萄糖脱氢酶、D-葡萄糖酸脱氢酶、2-酮基-D-古龙酸脱氢酶（存在于周质中）与2，5-DKG还原酶（存在于胞质）在细胞中所处位置的较大差异造成。

后来Grindley等经过改进,将棒杆菌的2，5-DKG还原酶的基因在E.citreus上表达，将收率提高至49%。

所有这些都为最终构建基因工程菌打下了基础。

二步发酵法发酵条件优化

“二步发酵法”是在“莱氏法”一步发酵的基础上继续经过氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacteroxydans）（俗称小菌）和其伴生菌芽孢杆菌（Bacillusspp.）（俗称大菌）两种菌株的混合发酵[1-2]生产Vc的前体物质2-酮基-L-古龙酸（2-KLG）。

该方法在Vc生产中一直占据着主导地位。

本实验研究了混合菌系的发酵条件，优化混合菌系的发酵工艺。

1实验材料

1.1菌种

氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacteroxydans）（俗称小菌）,蜡状芽孢杆菌（Bacilluscereus）,巨大芽孢杆菌（Bacillusmegatherium）（俗称大菌）。

1.2培养基

种子培养基：

L-山梨糖1.5%，玉米浆0.3%，蛋白胨0.5%，尿素0.4%，KH2PO40.1%，MgSO4·

7H2O0.02%，CaCO30.03%，pH6.8~7.0,121℃灭菌30min。

一次投糖发酵培养基：

L-山梨糖8%，玉米浆1.5%，尿素0.01%，MgSO4·

7H2O0.01%,消沫剂0.005%，酵母膏0.01%，（NH4）2SO40.01%，CaCO30.05%，，121℃灭30min，分离培养基。

2实验方法

2.1种液的制备

用适量无菌水洗斜面，然后取少量混菌液接种到250mL三角瓶培养48h,涂布到分离培养基平皿上，培养4~5d后大小菌搭配，然后在（30±

1）℃条件下茄子瓶斜面培养4d，经摇瓶扩大培养后，最后接到10L不锈钢种子罐中培养18~24