pUC19质粒DNA地提取纯化及检测.docx

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pUC19质粒DNA地提取纯化及检测

大学实验报告2013年9月19日至10月3日

系年级2011级生物技术组别四科目分子实验学号

同组者题目pUC19质粒DNA的提取，纯化及检测

一、【实验题目】

pUC19质粒DNA的提取，纯化及检测

2、【实验目的】

1.掌握碱变性提取法提取质粒的基本原理和方法，理解各种试剂的作用。

2.掌握质粒纯化的基本原理及各种试剂的作用。

3.掌握琼脂糖凝胶电泳进行质粒检测分离的原理。

4.掌握琼脂糖凝胶电泳的制备和电泳方法。

5.掌握琼脂糖凝胶电泳的观察方法及凝胶成像仪的操作方法。

三、【实验试剂与器材】

1.材料

大肠杆菌DH5（E.coliDH5）

2.试剂

LB液体培养基，氨苄青霉素（Amp）母液（20mg/ml），溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，3MNaAc溶液，无水乙醇，70%乙醇，TE溶液，RnaseA,苯酚/氯仿/异戊醇（25：

24：

1），灭菌双蒸水ddH2O，1×TAE，6×loadingbuffer，SupercoiledDNALadderMarker，λ-HindIIIdigestDNAMarker，溴化乙锭（EB）

3.仪器

培养皿，接种环，三角瓶（100ml、300ml），酒精灯，恒温振荡培养箱，50ml离心管，1.5ml塑料离心管（eppendorf管），高速离心机，漩涡振荡器，移液枪，不同型号枪头（10ul，200ul，1ml），电泳仪，微波炉，灭菌锅，吸水纸，记号笔，移液管，洗耳球，PE手套，橡胶手套，滴管，天平，称量纸，冰箱，凝胶成像仪等

4、【实验原理】

1.碱变性法提取质粒及酚、酚/氯仿、氯仿/异戊醇纯化质粒

质粒由于分子小、能自主复制、携带抗性基因、便于分离和提取，经常用在DNA重组中，携带目的基因进入细菌、动物细胞或植物体进行扩增与表达，是基因工程中一种非常重要的载体。

构建重组DNA分子需要首先从宿主细胞中提取高质量的质粒DNA。

提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：

碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。

其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。

该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。

提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。

碱变性提取质粒DNA一般包括三个步骤：

培养细菌以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。

在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。

细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。

在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。

当用pH值4.6的KAc（或NaAc）高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可以恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。

这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。

溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。

由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNaseA将RNA降解。

质粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。

2.琼脂糖凝胶电泳

电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。

各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。

凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。

含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。

利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。

因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。

凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨围极广。

此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭或SYBRGold染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。

需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。

分子生物学实验中，常用的两种凝胶为琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。

这两种凝胶能灌制成各种形状、大小和孔径，也能以许多不同的构型和方位进行电泳。

选择上述提及的参数或条件主要取决于被分离的DNA片段的大小。

聚丙烯酰胺凝胶分辨率高，适用于较小分子核酸（5~500bp）的分离和蛋白质电泳。

它的分辨率非常高，长度上相差1bp或质量上相差0.1%的DNA都可以彼此分离，这也是采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行DNA序列分析的分子基础。

虽然它能很快地进行电泳，并能容纳较大的DNA样量，但是与琼脂糖凝胶相比，在制备和操作上还是繁琐些。

聚丙烯酰胺凝胶电泳是在恒定电场中垂直方位上进行的。

琼脂糖是从海藻中提取的长链状多聚物，由β-D-吡喃半乳糖与1,4连接的3,6-脱水-L-吡喃半乳糖组成，相对分子质量为104~105。

当琼脂糖加热至90℃左右，即可熔化形成清亮、透明的液体，浇在模板上冷却后固化形成凝胶，其凝固点为40~45℃。

琼脂糖比聚丙烯酰胺凝胶的分辨率略低，但它的分离围更大（50至百万bp），小片段DNA（50~20000bp）最适合在恒定强度和方向的电场中水平方向的琼脂糖凝胶电泳分离。

琼脂糖凝胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，测定DNA的相对分子质量，分离经限制酶水解的DNA片段，进一步纯化DNA等。

琼脂凝胶糖电泳是一种常用的方法。

在溶液中，由于核酸有磷酸基团而带负电荷，在电场中向正极移动。

DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率主要取决于下面6个因素：

（1）样品DNA分子的大小：

电泳时，线性双螺旋DNA分子是以头尾位向前迁移的，其迁移速度与相对分子质量（所含碱基）的对数值成反比，这是因为大分子有更大的摩擦阻力。

（2）DNA分子的构象：

相对分子质量相同而构象不同的DNA分子，其迁移速率不同。

在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA的一条链断裂，变成开环DNA，如果两条链发生断裂，就转变为线状DNA分子。

这三种构型的分子有不同的迁移率。

一般情况下，超螺旋型迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的是开环状分子。

（3）琼脂糖浓度：

琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径，一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的泳动速度不同。

通常凝胶浓度越低，则凝胶孔径越大，DNA电泳迁移速度越快，因此，相对分子质量越大，选用的凝胶浓度应越低。

（4）电泳所用电场：

低电压条件下，线性DNA片段的迁移速率与所用电压成正比，电压越高，带电颗粒泳动越快，但随着电场强度的增加，不同长度DNA泳动的增加程度不同，因此凝胶电泳分离DNA的有效围随着电压上升而减少。

为了获得DNA片段的最佳分离效果，电场强度应小于5V/cm。

（5）缓冲液：

缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。

当电泳液为去离子水，溶液的导电性很少，带电颗粒泳动很慢，DNA几乎不移动；而在高离子强度下，导电性极高，带电颗粒泳动很快，产生大量的热，有时甚至熔化凝胶或使DNA变性。

电泳时常用的缓冲液有乙酸盐（TAE）、硼酸盐（TBE）和磷酸盐（TPE）几种不同的电泳缓冲液，通常配成10×或5×的浓缩母液保存于室温下，用时稀释至工作浓度。

电泳缓冲液的工作浓度约50mmol/L，工作pH在7.5~7.8之间。

TAE缓冲液缓冲能力弱，长时间电泳缓冲能力逐渐丧失（阳极变碱性，阴极变酸性），长时间电泳需要更换缓冲液；TBE、TPE缓冲液缓冲能力较强，可以重复使用数次。

TAE缓冲液可以分离数kb长度的DNA，在精制DNA片段以及染色体DNA进行杂交时比较常用。

相反，TBE缓冲液适于鉴定、分离短小的DNA片段。

（6）温度：

琼脂糖凝胶电泳时，不同大小DNA片段的相对电泳迁移率在4~30℃无变化，一般琼脂糖凝胶电泳多在室温下进行，而当琼脂糖含量少于0.5%时，凝胶很脆弱，最好在4℃下电泳以增加凝胶强度。

3.常用的DNA分子标准物的电泳图谱及分子大小

五、【实验步骤】

1.准备实验

配制LB液体培养基，分装至100ml三角瓶中20ml，300ml的三角瓶中50ml，包扎。

另配LB固体培养基，包扎；准备10ul、200ul、1ml枪尖各一盒，1.5ml离心管若干于500ml三角瓶中，50ml离心管2个，移液管，包扎、标记，连同LB培养基一同灭菌。

2.菌体培养

（1）点燃酒精灯，将接种环在酒精灯上灼烧，冷却，灭菌

（2）向20ml液体LB培养中加入20ul氨苄青霉素，混合均匀。

（3）在含有氨苄青霉素的LB平板上，用接种环挑取提前活化的含有有质粒pUC19的E.coliDH5单菌落，接种于

（2）的培养基中，之一接种环的圆环处在液壁交界面研磨至菌苔分散进入培养液。

（4）用棉塞塞住瓶口，用牛皮纸包住，并用绳子系紧。

（5）37℃，200rpm振荡培养过夜，约12h。

3.扩大培养

吸取菌液0.8ml转接至含氨苄青霉素的80mlLB液体培养基（Amp100ug/ml）中，37℃，200rpm振荡培养6h。

4.质粒提取

（1）称量一个50ml离心管的重量w1，记录为14.53g。

（2）将35ml菌液转入离心管，标记为2-4-1。

菌液应距管口1cm以防离心时菌液外溢，与其它组同学配平后，于6000rpm离心5min，弃上清。

（3）加入5ml溶液Ⅰ打散菌体洗涤，用漩涡振荡器混匀，于6000rpm离心5min，弃上清，称重w2为14.69g,所以菌泥重量为0.16g.

（4）向离心管中加入2.0ml溶液Ⅰ,充分涡旋振荡，冰浴5min。

（5）向离心管中加入4.0ml溶液Ⅱ，悬滴快速加入，轻柔颠倒混匀，发现离心管中的溶液变得有一些粘稠，冰浴5min。

（6）向离心管中加入3.0ml溶液Ⅲ，缓慢轻柔上下颠倒混匀，发现离心管中出现了白色絮状沉淀物，冰浴5min。

（7）12000rpm离心15min，将上清液轻轻转入新的离心管2，标记为2-4-2，记录上清液体积V为9ml.

（8）加入18ml冰乙醇，混匀，-20℃静置15-30min。

（9）12000rpm离心15min,弃上清。

（10）加入5ml70%乙醇，12000rpm离心5min,弃上清。

（11）重复洗涤一次；吸弃上清，37℃风干5-10min。

（12）分次加入1mlTE溶解沉淀并转移到Ep管中，得到质粒DNA粗提物，加入50ulRNaseA，37℃静置1-2h,-20℃保存待用。

5.质粒纯化

（1）向上次得到的粗提物平均分装至两个Ep管中。

（2）用滴管悬滴加入500ulTris饱和酚溶液，振荡混匀，配平后于12000rpm离心5min，观察到溶液分为三层，上层澄清，中间为白色的蛋白，下层淡黄色。

（3）将上清液转入新管，记录两管的体积均为450ul。

（4）用滴管分别向两管悬滴加入450ul苯酚：

氯仿：

异戊醇溶液，颠倒混匀，观察到溶液分为两层，两层均是透明无色，配平后于12000rpm离心5min。

（5）将上清液转入新管，其中1号管体积为400ul，2号管体积为360ul。

（6）用滴管向1号管悬滴加入400ul氯仿/异戊醇，向1号管悬滴加入360ul氯仿/异戊醇，颠倒混匀，配平后于12000rpm离心5min。

（7）将上清液转入新管，两管转移的液体的体积均为350ul。

（8）向上清液中加入35ul3MNaAc，混匀，加入770ul的冰无水乙醇混匀，-20℃沉淀30min。

（9）配平后于12000rpm离心15min.，弃上清。

（10