罗丹明BMn2+H2O2体系同步荧光分光光度法.docx

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罗丹明BMn2+H2O2体系同步荧光分光光度法

罗丹明B-Mn2+-H2O2体系同步荧光分光光度法

测定水果的抗氧化活性

摘要在稀硫酸介质中,Mn2+-H2O2体系产生的羟自由基迅速氧化罗丹明B使其褪色。

在579nm处测定吸光度的变化,可间接测定羟自由基的生成量。

水果提取物可以消除溶液中的羟自由基,从而使溶液的吸光度下降程度减弱。

据此建立了一种测定水果对羟自由基的清除率的新方法。

测定了4种常见水果的抗氧化性,其中苹果和橙子的抗氧化性较强。

1前言

羟自由基（·OH）是活性氧中对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基。

它可以通过电子转移、加成以及脱氢等方式与生物体内的多种分子作用，造成糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等物质的氧化性损伤，使细胞坏死或突变。

羟自由基还与衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬有关。

对机体适当补充外源性抗氧化剂或给予能促使机体内源性物质恢复到一定水平的药物，可改善这些状况。

由于长期使用化学合成的抗氧化剂对入体有一定的副作用，所以，寻找天然、安全、无毒的抗氧化剂就越来越受到入们的重视。

对羟自由基的研究有许多，例如：

荧光法研究高粱红色素清除羟自由基活性，为高粱红色素的合理开发和利用提供了一定的参考依据；罗丹明6G-Co2+-H2O2体系荧光法测定常见蔬菜的抗氧化活性，测定了14种常见的蔬菜的抗氧化活性，其中菠菜、油菜、韭菜、香菜、雪里蕻5种绿叶蔬菜的抗氧化活性较强；丁基罗丹明B-Fe2+-H2O2体系荧光法测定茶叶的抗氧化活性，对多种茶叶及枸杞的清除羟自由基作用进行了研究，充分利用了丰富的茶叶资源提高入体抗氧化性能。

目前，离体检测羟自由基的方法主要有电子自旋共振（ESR）法、化学发光法、光度法及荧光法，这些方法多是用传统的Fe2+-H2O2体系产生羟自由基，或Cu+、Co2+、代替Fe2+[5、6]使灵敏度提高，对水果抗氧化活性的研究已有报道。

本文采用罗丹明B作指示剂，在Mn2+-H2O2体系产生羟自由基（·OH），测定水果的抗氧化活性。

从常见水果中寻找抗氧化剂，充分利用丰富的水果资源，具有实际意义。

2测定原理

传统的Fenton反应是用Fe2+-H2O2体系产生羟自由基。

本文研究发现，Mn2+亦可与H2O2作用，类似Fenton反应产生羟自由基，产率比FeSO4还要高，其反应原理可类推如下:

Mn2++H2O2→Mn（Ⅲ）+·OH+OH-

Mn（Ⅲ）十H2O2→Mn（IV）+·OH+OH-

然后，利用羟自由基迅速氧化罗丹明B，使罗丹明B的荧光强度显著降低，降低程度随羟自由基的增加而加大，从而间接测定羟自由基的产生量。

而水果提取物可以部分清除溶液中的羟自由基，从而使其荧光猝灭程度减弱，据此可以测定水果抗氧化性。

3实验部分

3.1主要仪器与试剂

3.1.1主要仪器

F-4600型分子荧光分光光度计日本日立公司

SQ2119多功能食品加工机上海帅佳电子科技有限公司

TD4台式离心机湖南仪器表总厂离心机长

电子分析天平梅特勒-托利多仪器上海有限公司

PHSJ-3F实验室pH计上海精密科学仪器有限公司

3.1.2主要试剂

MnSO4·H2O（含量不少于99%）天津市北方天医化学试剂厂

抗坏血酸（含量不少于99.7%）天津市福晨化学试剂厂

H2O2（含量不少于30%）天津市凯通化学试剂有限公司

罗丹明B天津市津科精细化工研究所

氯化铵（含量不少于99.5%）天津市津东天正精细化学试剂厂

氨水（含量不少于25%-28%）天津市赢达希贵化学试剂厂

所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

3.2储备液的配制

干燥的小烧杯若干，100mL容量瓶3只，1000mL的容量瓶1只，聚乙烯塑料瓶，500mL容量瓶两只，50mL容量瓶5只，10mL容量瓶20只，2mL移液管4只，贴上标签（罗丹明B，Mn2＋，H2O2，buffer。

），100ml量筒一只，10mL移液管两只（缓冲）

3.2.1硫酸锰储备液的配制

准确称取MnSO4·H2O（M=169）0.3397g，在小烧杯中用少量水溶解转移100mL容量瓶中定容，配制成20mmol/L溶液作为储备液。

实验所用的浓度是2mmol/L，移取10mL20mmol/L储备液于100mL的容量瓶中定容至刻度。

3.2.2罗丹明B储备液的配制

准确称取罗丹明B0.01g左右，在小烧杯中溶解，转移定容在1000mL的容量瓶中，配成1×10-2g/L的储备液。

3.2.31%双氧水储备液的配制

移取30%H2O23mL于聚乙烯的塑料瓶中，再加87mL的蒸馏水（都用量筒）。

3.2.4.0.1mol/L氨水储备液的配制

准确移取3.33mL浓氨水，稀释至500mL的容量瓶中，定容至刻度，转移在500mL的细口瓶中，配置成0.1mol/LNH3·H2O的储备液。

3.2.5.0.1mol/L氯化铵储备液的配制

准确称取2.675g左右氯化铵（M=53.49），在小烧杯中用少量水溶解，转移定容在500mL的容量瓶中，转移在500mL的细口瓶中，配置成0.1mol/LNH4Cl的储备液。

3.2.6根据化学手册配制成不同pH值NH3-NH4Cl缓冲溶液：

0.1mol/LNH4ClV/mL

32

32

30

25

15

0.1mol/LNH3·H2OV/mL

1

4

15

25

30

pH

8.0

8.58

9.1

9.5

9.8

10mL移液管，配于50mL容量瓶中，注意不要定容！

3.2.7抗坏血酸储备液的配制

准确称取抗坏血酸0.3523g，在小烧杯中用少量水溶解，转移定容在100mL的容量瓶中，得到20mmol/L的储备液。

实验时，移取2.5mL20mmol/L的抗坏血酸，转移定容在100mL的容量瓶中得到0.5mmol/L的抗坏血酸。

3.3实验方法

3.3.1羟自由基的测定

在10mL容量瓶中，pH9.8的缓冲溶液1.0mL，加入1Χ10-2g/L的罗丹明B1.6mL，2.0mmol/L的Mn2+溶液2.0mL，1%的H202溶液1.0mL，加蒸馏水至刻度，混匀。

测定579nm波长处的荧光强度F，计算其与空白参比（罗丹明B与缓冲液）荧光强度F0之差△F，通过测定·OH形成前后罗丹明B的荧光强度变化，来反映·OH的产生量。

3.3.2羟自由基清除率的测定

在上述体系中加入一定量的羟自由基清除剂，同样操作侧定荧光强度Fs;罗丹明B和缓冲溶液作为空白体系，其荧光强度为F0，未加清除剂的体系，其荧光强度为F，则清除率=（Fs-F）/（F0-F）×100%

3.3.3水果水提取物清除·OH的作用

新鲜水果洗净，晾干，准确称取20g，加入200mL蒸馏水，匀浆3min，过滤，离心5min，取上层清液0.6mL按上述方法进行测定。

4结果与讨论

4.1.荧光光谱

罗丹明B本身能产生特征荧光，其激发波长和发射波长分别为553nm和579nm，

1、罗丹明B+缓冲溶液

2、罗丹明B+缓冲溶液+Mn2++H2O2+抗坏血酸

3、罗丹明B+缓冲溶液+Mn2++H2O2

图1荧光光谱

4.2实验参数

工作模式：

发射扫描扫描间隔：

2nm激发狭缝:

6nm

发射狭缝：

6nm负高压：

130V

4.3实验条件

实验条件对羟自由基的产生有影响，也对抗氧化剂对羟自由基的清除率有影响，应综合考虑这两方面的因素，选择适宜的测定条件。

4.3.1酸度的影响

强酸性介质中罗丹明B基本无荧光，弱酸性介质中罗丹明B的荧光很弱，碱性介质中，罗丹明B发强荧光，空白和羟自由基体系的△F受pH值的影响如图2所示。

可以看出，在pH=9.8时△F有较大值，故选用弱碱性介质pH9.8的缓冲溶液。

缓冲各1mL（pH=）

8.0

8.58

9.1

9.5

9.8

罗丹明B（1×10-2g/L）/mL

1.6

1.6

1.6

1.6

1.6

Mn2+（2.0mmol/L）/mL

2

2

2

2

2

H2O2（1%）/mL

0.8

0.8

0.8

0.8

0.8

1’

2’

3’

4’

5’

缓冲各1mL（pH=）

8.0

8.58

9.1

9.5

9.8

罗丹明B（8×10-4g/L）/mL

1.6

1.6

1.6

1.6

1.6

ΔF

12.2

-2.6

71

78.2

92.7

图2

4.3.2罗丹明B的用量

加入不同体积1×10-2g/L罗丹明B溶液，按试验方法测定空白体系和·OH体系的△F，如图3所示，结果表明罗丹明B用量为1.6mL。

缓冲（pH=9.8）/mL

1

1

1

1

1

罗丹明B（1×10-2g/L）/mL

1

1.2

1.4

1.6

1.8

Mn2+（2.0mmol/L）/mL

2

2

2

2

2

H2O2（1%）/mL

0.8

0.8

0.8

0.8

0.8

1’

2’

3’

4’

5’

缓冲（pH=9.8）/mL

1

1

1

1

1

罗丹明B（8Χ10-4g/L）/mL

1

1.2

1.4

1.6

1.8

ΔF

72.9

71.7

71.1

101.5

85.5

图3

4.3.3硫酸锰的用量

按实验方法加入不同体积2mmol/L的MnSO4溶液，测定荧光强度，如图4所示，选用MnSO4溶液为2.0mL。

缓冲（pH=9.8）/mL

1

1

1

1

1

罗丹明B（1×10-2g/L）/mL

1.6

1.6

1.6

1.6

1.6

Mn2+（2.0mmol/L）/mL

0.8

1

1.2

1.6

2

H2O2（1%）/mL

0.8

0.8

0.8

0.8

0.8

ΔF

59.1

55.3

71.1

64.8

81.7

1’

缓冲（pH=9.8）/mL

1

罗丹明B（1×10-2g/L）/mL

1.6

图4

4.3.4过氧化氢的用量

用不同体积1%的H2O2按试验方法测定荧光强度，如图5所示，本实验选用H2O2溶液1.0mL。

缓冲（pH=9.8）/mL

1

1

1

1

1

罗丹明B（8Χ10-4g/L）/mL

1.6

1.6

1.6

1.6

1.6

Mn2+（2.0mmol/L）/mL

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

H2O2（1%）/mL

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

ΔF

82.4

83.7

115.6

87.0

114.4

1’

缓冲（pH=9.8）/mL

1

罗丹明B（1×10-2g/L）/mL

1.6

图5

4.5抗氧化剂清除羟自由基作用的测定

于体系中加入抗坏血酸，按试验方法测定空白体系的F0，·OH体系的F，加清除剂体系的Fs。

荧光强度变化如图1所示，结果表明，随抗坏血酸用量增加，清除率加大。

说明本体系中抗坏血酸与·OH的清除作用有明显的量效关系。

4.6水果的抗氧化作用

测定了4种新鲜水果的水提取物对·OH的清除率，结果见表2。

从表中看出橙子、苹果具有较强的清除·OH的功能。

清除率=（Fs—F）/（Fo—F）×100%

表2各种水果的清除率

水果

清除率（%）

梨

31.92

橙子

38.75

猕猴桃

31.57

苹果

39.1

5结果讨论

从这次实验中可以看出水果盘蔬菜中含有大量天然抗氧化剂、且提取率高、抗氧化活性强，其与机体亲和力强和安全性高等优点具有取代合成抗氧化剂趋势，是今后的研究重点。

另外，天然抗氧化剂尚需在有效成分的抗氧化机理、协同作用、构效关系和分子设计等方面开展深入研究，为天然植物开发抗氧化剂的应用奠定理论基础；同时要加强天然植物原料提取、分离纯化有效成分工艺研究，以尽快实现天然抗氧化剂的产业化。

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业学报.2010.第25卷第6期

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体系荧光法测定常见水果的抗氧化活性.分析科学学报.2005.2.第21卷第1期