最新RTPCR详细图文解析.docx
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最新RTPCR详细图文解析
一、实时荧光定量PCR原理
（一）定义：
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
（二）实时原理
1、常规PCR技术：
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。
2、实时定量PCR技术：
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析
3、如何对起始模板定量？
通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析.
4、几个概念：
（1）扩增曲线：
（2）荧光阈值：
（3）Ct值：
CT值的重现性：
5、定量原理：
理想的PCR反应：
X=X0*2n
非理想的PCR反应：
X=X0（1+Ex）n
n：
扩增反应的循环次数
X：
第n次循环后的产物量
X0：
初始模板量
Ex：
扩增效率
5、标准曲线
6、绝对定量
1）确定未知样品的C（t）值
2）通过标准曲线由未知样品的C（t）值推算出其初始量
7、DNA的荧光标记：
二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍
方法一：
SYBRGreen法
（一）工作原理
1、SYBRGreen 能结合到双链DNA的小沟部位
2、SYBRGreen 只有和双链DNA结合后才发荧光
3、变性时，DNA双链分开，无荧光
4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBRGreen发荧光，在此阶段采集荧光信号。
PCR反应体系的建立及优化:
1、SYBRGreen使用浓度:
太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测
2、Primer：
引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准
3、MgCl2的浓度:
可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物
4、反应Buffer体系的优化
5、反应温度和时间参数:
由酶和引物决定
6、其他与常规PCR相同
（二）应用范围
1、起始模板的测定；
2、基因型的分析；
3、融解曲线分析：
可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。
（三）优点及缺点
优点：
对DNA模板没有选择性；适用于任何DNA；使用方便；不必设计复杂探针；非常灵敏；便宜。
缺点：
容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性；但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件； 对引物特异性要求较高。
方法二：
TaqMan---水解型杂交探针
**5′端标记有报告基团（Reporter,R） ，如FAM、VIC等
**3′端标记有荧光淬灭基团（Quencher,Q）
**探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光
**Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
（一）工作原理
注意：
每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光
PCR反应的建立：
1、引物、探针的设计：
探针Tm为68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，
引物尽量靠近探针，扩增片段<400bp，引物Tm为59-60℃
2、反应参数的确定：
一般为：
94℃，10-20S
60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高）
也可通过温度梯度优化退火温度72℃，45S，
3、优化引物和探针浓度：
获得最小Ct值，信号/背景比值的最大值
引物浓度：
50-900nM
探针浓度：
50-250nM
4、其他与常规PCR相同
（二）优缺点
优点：
对目标序列的高特异性
------阴性结果确定
设计相对简单
------与目标序列某一区域互补
重复性比较好
缺点：
只适合一个特定的目标;
委托公司标记，价格较高;
不易找到本底低的探针
（9）钢筋混凝土盖板施工工艺
A施工准备
开工前准备了各种原材料。
钢筋、水泥具有出厂质量证明书。
钢筋按不同钢种、等级、牌号、规格及生产厂家分批验收、分别堆存。
钢筋在运输、储存过程中，我们避免了锈蚀和污染。
钢筋堆置在专门的棚中，露天堆置时，我们采取了垫高措施并加遮盖。
配合比设计：
水泥混凝土配合比及砂浆配合比设计满足有关技术规范要求，并已报监理工程师审批。
开工前完成对模板、支架等相关材料的检测、维修工作，其几何尺寸、精度及有关特性均满足图纸及有关规范要求。
开工前，向监理工程师提供有关施工方法及工艺安排的书面报告，获得批准后方可施工。
B施工测量放线
对建设单位所交付的涵洞中线位置桩、水准基点桩等及其测量资料进行检查、核对，发现桩志不足、不稳妥、被移动或测量精度不符合要求的，已按规范要求进行补测、加固、移设或重新测校，并上报监理工程师和设计单位及业主。
测定基础、八字翼墙位置。
补充施工需要的水准点。
在施工过程中，测定并检查施工部分的位置和标高。
C涵台台身及台帽施工
基础采用C25混凝土现浇而成。
砼采用强制式搅拌机，当混凝土到现场时，检查其坍落度、均匀性等指标，合格后方可使用。
砼振捣采用插入式振捣器，砼振捣应充分密实为止。
密实的标志是混凝土停止下沉，不再冒出气泡，表面呈现平坦、泛浆现象为止。
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