浅论microRNA.docx

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浅论microRNA

浅论microRNA

【摘要】【目的】研究microRNA-21（miR-21）对膀胱癌T24细胞系中血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）和活化因子蛋白-1（activatorprotein-1，AP1）及mRNA表达的调节作用，探讨miR-21对膀胱癌T24细胞增殖的影响。

【方法】用人工合成的miR-21相应的双链互补DNA片段，插入pSilencerTM　neo载体表达载体，经测序鉴定后作为microRNA的表达质粒;用脂质体将miR-21高表达质粒转染进T24膀胱癌细胞，经G418筛选获得阳性克隆。

用RT-PCR技术和Westernblot方法分别检测该细胞系中VEGF和AP1的mRNA和蛋白表达情况。

四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测膀胱癌T24细胞增殖的变化情况。

【结果】Westernblot结果显示miR-21能够增加VEGF和AP1蛋白的表达，RT-PCR方法分析显示VEGF和AP1mRNA水平升高。

MTT显示转染后细胞的生长速率比未转染的细胞明显加快。

【结论】miR-21促进T24膀胱癌细胞增殖，提示可能与VEGF和AP1的低表达有关。

【关键词】microRNA-21;VEGF;AP1;T24细胞;膀胱肿瘤

　Abstract：

【Objective】ToinvestigatetheroleofmiR-21ontheexpressionofvascularendothelialgrowthfactor（VEGF）andactivatorprotein-1（AP1）proteinanditsmRNA，andtoexploretheeffectofmicroRNA-21inregulationoftheproliferationofT24bladdercancercells.【Methods】Usingthesyntheticdouble-strandbasepair（bp）DNA，whichisbasedonthesequenceofthemiR-21，insertedtheDNAofmiR-21intothevectorofpSilencerTM　neo，andclonedthemicroRNAhighlyexpressionplasmid.ThenthemiR-21plasmidweretransferredintoT24withLipofectamine2000，consequentlycelllinewiththemiR-21highlyexpressionwasestablishedbyscreeningwithG418.ThelevelofVEGFandAP1mRNAandproteinweremeasuredbyusingRT-PCRandWesternblotting，respectively.Methylthiazolyltetrazolium（MTT）wasusedtoanalyzetheproliferationoftheT24.【Results】TheWesternblotresultsdisplayedthatmiR-21promotedtheexpressionoftheVEGFandAP1protein.RT-PCRalsoindicatedthatthemRNAofVEGFandAP1increased.Comparedwiththecontrolgroup，MTTmethoddemonstratedthatthegrowthrateofT24treatedwiththemiR-21highexpressionwasalsosignificantlyincreased.【Conclusion】miR-21canpromotetheproliferationofT24，suggestingthatitwasrelatedtothelowexpressionofVEGFandAP1.

　　]膀胱肿瘤是泌尿系统中最常见的肿瘤，在国内膀胱肿瘤的发病率在男性泌尿生殖器肿瘤中占首位，其中男性发病率约为女性的3～4倍，年龄以50～70岁为多，严重危害人类的健康。

microRNAs（miRNAs）是一类可调控基因表达的内源性非编码单链小分子RNA，长度约18～24个核苷酸，通过与靶mRNA特异的碱基配对，引起靶mRNA降解或者翻译抑制，产生转录后基因沉默。

miRNAs的作用涉及多种生理和病理过程，已有大量实验证据表明，miRNAs在肿瘤[1-2]、心血管[3-4]、糖尿病、胚胎发育[6-7]中异常表达。

最新研究显示，microRNA与膀胱癌关系密切，Gottardo等通过寡核苷酸芯片分析27例膀胱癌组织（25例癌组织和2例正常组织），分析发现miR-223，miR-26b，miR-221，miR-103-1，miR-185，miR?

鄄23b，miR-203，miR-17-5p，miR-23a和miR-205表达显着上调。

miR-21在癌症中十分活跃，有研究显示其在乳腺癌、肝癌[10]等癌症中高表达，但是其在膀胱癌中作用鲜有报道。

我们的实验就miR-21对膀胱癌VEGF和AP1蛋白及mRNA表达的调节作用及膀胱癌T24细胞增殖的影响做了初步探讨，报道如下。

　　1材料与方法

　　材料

　　膀胱癌T24细胞系（上海拜力生物公司）;质粒提取试剂盒（Invitrogen）;总RNA提取试剂盒（Invitrogen）;RT试剂盒（MBI）;PCR试剂盒（Invitrogen）;LipofectamineTM2000转染试剂盒（Invitrogen）;MTT试剂盒（Sigma）;引物合成（Invitrogen）;载体H1neo（Ambion）;　DH5（Ambion）。

　　方法

　　细胞的培养和miR-21高表达质粒的构建

　　T24细胞培养于添加100mL/L胎牛血清的1640培养液中，37℃，体积分数为5%的CO2孵箱中培养。

根据miR-21的核苷酸序列5′-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3′，首先用DNA合成技术得到第一链DNA，接着用DNA连接反应合成双链DNA，之后插入pSilencerTM　neo载体。

将构建好的质粒转化进DH5α。

转染后进行质粒扩增和提取。

　　脂质体介导的细胞转染

　　每孔20×104个细胞接种于六孔板中，24h后，按、、、、g/LG418的量向相应孔中加入含有100mL/L血清的培养基，每4d换含抗生素的培养基，培养14d后观察结果，然后根据观察结果，筛选出维持浓度。

根据质粒提取试剂盒和LipofectamineTM2000转染试剂盒的说明书进行转染。

用维持浓度的培养液培养转染的细胞，筛选形成的阳性克隆，挑取阳性克隆进行扩大培养，之后收集细胞进行Northernblotting鉴定。

　　Westernblotting检测蛋白表达

　　将蛋白提取之后，按照蛋白质定量试剂盒（CatalogNumber：

23250）的说明书进行蛋白定量，将提取蛋白进行Westernblotting.

　　RT-PCR检测mRNA表达

　　按照总RNA提取试剂盒（Invitrogen）说明书提取总RNA，运用BeaconDesigner　软件进行引物设计，以（oligo）dT为引物逆转录合成cDNA第一链，以4μL的cDNA为模板进行PCR扩增，β-actin为内参照.取5μLPCR产物%琼脂糖凝胶电泳。

　　MTT法检测细胞的增殖

　　%胰蛋白酶消化单层培养的T24细胞，用含100mL/L血清的1640培养基制成单个细胞悬液，以每孔3×104个细胞接种于24孔培养板中，每孔培养基600μL。

将细胞放入37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，待细胞长到50%融合时更换无血清的1640培养基同步化24h，后加100mL/L血清，在不同时间段（24，48，72h）测值时往培养板中加入10×MTT，继续培养4h，弃去培养基，加入150μLDMSO，室温孵育10min，待紫色结晶完全溶解后，用Elx-800酶联免疫检测仪测定A570nm值，以A570nm值代表细胞活力。

　　统计学方法

　　所有实验重复3次，结果以x±s表示，用SPSS统计软件进行分析，以P　为有统计学意义。

　　2结果

　　miR-21高表达质粒构建

　　选取经过初步鉴定的阳性克隆进行DNA测序，结果显示插入片段的阅读框正确，所测序列与目的序列一致。

　　miR-21高表达质粒细胞系的建立

　　G418筛选浓度的测定

　　正常T24进过14d的加药筛选，结果如图1所示，细胞在加G418筛选到10d时，G418浓度为g/L培养液的样品，细胞已经全部死亡。

在第14天时，G418浓度为g/L培养液的细胞样品尚有部分细胞存活，浓度为g/L的细胞样品已经被全部杀死。

选择g/LG418培养液的药物浓度为含高表达质粒阳性克隆筛选的加药浓度。

　　含miR-21高表达质粒克隆的筛选

　　用提取的质粒转染T24细胞，24h后传代，加G418（g/L培养液）筛选，培养14d后观察所得结果如图2。

正常对照细胞已经全部杀死，转染了质粒的细胞形成了多个不同的阳性克隆，挑取克隆并扩大培养。

　　稳定表达细胞系中VEGF和AP1表达情况检测

　　稳定表达细胞系VEGF和AP1蛋白质的表达检测

　　将经过鉴定的细胞系进行扩大培养，提取细胞总蛋白，对其进行蛋白定量后。

经过电泳、转膜、孵抗、显影后获得如下结果（图3）。

结果显示，相对于正常组和空质粒组，转染了pSil-miR-21高表达质粒的T24的VEGF和AP1蛋白表达受到了促进作用，其中VEGF蛋白的表达增加了（±）%（P　），AP1蛋白增加了（±）%（P　），而正常组、空质粒组的组间差异无统计学意义（P　）。

　　miR-21对VEGF和AP1mRNA表达的影响

　　用AP1和VEGF基因特异引物进行RT-PCR检测。

AP1的PCR条件：

94℃预变性3min，94℃变性30s、℃退火30s、72℃延伸1min，30个循环后再72℃终末延伸5min;VEGF的PCR条件：

94℃预变性4min，94℃变性1min、58℃退火1min、72℃延伸1min，31个循环后再72℃终末延伸5min;GAPDH的PCR条件：

94℃预变性4min，然后94℃变性1min、58℃退火1min、72℃延伸1min，32个循环后再72℃终末延伸10min（图4）。

结果显示转染了pSil-miR?

鄄21高表达质粒的T24的VEGF和AP1mRNA受到了不同程度的促进作用，VEGFmRNA的表达增加了（±）%（P　），AP1增加了（±）%（P　）而正常组、空质粒组的组间差异无统计学意义（P　）。

　　MTT法检测细胞增殖结果

　　MTT试验结果进行统计，如图5。

由结果可知转染了pSil-miR-21高表达质粒的T24的增殖情况受到促进，转染了pSil?

鄄miR-21的细胞增殖效果最强[48h，增殖率（±）%，P　]。

　　3讨论

　　miR-21与癌症

　　大量的资料显示，miR-21在肝癌、肺腺癌、乳腺癌等肿瘤中发现具有一定的调节作用。

Meng等[11]使用miRNA微阵列研究发现，miR-21在肝癌肿瘤细胞株中过表达，抑制培养的肝癌细胞中miR-21的表达，则磷酸酶和同源张力蛋白（PTEN）肿瘤抑制基因增加，肿瘤细胞的增殖、迁移和入侵能力下降。

此外，在正常的人肝细胞转染前体miR-21后，细胞迁移增加。

Schetter等[12]通过原位杂交表明miR-21在结肠癌细胞中的表达水平很高，高表达的miR-21与差的存活和治疗结果有关。

Frankel等[13]发现MCF-7乳腺癌细胞中，miR-21受到抑制是细胞生长减少的原因。

实验还发现，肿瘤抑制蛋白——细胞程序性死亡4（PDCD4）受miR-21调节，证明在乳腺癌细胞中，PDCD4是miR-21的一个重要的功能性靶点。

　　miRNA与膀胱癌

　　miR-21在膀胱癌发生发展中的作用研究较少。

Dyrskj?

觊t等[14]对106个膀胱癌组织和11个正常组织进行寡聚核苷酸分析，相对于正常组织，膀胱癌组织中miR-145下调最显着，miR-21上调最显着。

Lin等[15]通过实验发现，相对于正常膀胱上皮组织，膀胱癌的miRNA表达图谱显示37种miRNA上调，38种miRNA下调，其中miR-143在肿瘤中的表达是低于正常组织的倍。

微阵列分析，RNA印迹分析和实时PCR反应都证实了miR-143的显着下调表达。

在转染了miR-143的细胞中，RAS蛋白的表达显着下降。

实验证实microRNA在膀胱癌中异常表达，提示miR-143可能在在膀胱癌中作为一种肿瘤抑制因子。

我们课题组对膀胱癌的研究表明，miR-21对膀胱癌细胞具有一定的调节作用，高表达的miR-21细胞系中细胞的增殖速度加快，提示miR-21可以促进膀胱癌细胞的增殖。

　　VEGF和AP1在癌症中的作用

　　VEGF是血管新生的关键因素，它通过调控病理性血管发生和增加血管通透性而起作用，在人类各种肿瘤组织中，如膀胱癌、宫颈癌、乳腺癌、大肠癌等，都有高水平的VEGF表达。

AP1是一种转录因子，通过bZIP结构域的碱性区域与DNA序列结合，调节基因的转录，参与细胞的增殖、分化过程。

AP1在肿瘤形成及发展过程中，通过促进细胞增殖、抑制分化、促进肿瘤细胞的侵袭和转移等过程发挥作用参与转化、增殖、分化、凋亡等多种生物学功能[16]。

研究表明AP1的活化参与了VEGF和bFGF的异常表达，参与恶性肿瘤的转移过程[17]。

在我们的实验中发现，miR-21高表达质粒组的VEGF和AP1蛋白受到促进作用，实验结果提示在T24细胞中，VEGF和AP1可能是miR-21发挥作用的重要蛋白。

　　问题与展望

　　本研究中有如下几个问题需要解决：

①本实验的质粒转染过程中，我们分别采用了瞬时转染和稳转两种方法，且质粒带有荧光标记，但是两种方法的效果相差较大。

可能是因为瞬时转染时间短，且对细胞的伤害较大，所以目的蛋白的表达不明显。

但是后期稳转建立的细胞系比较稳定，达到了预期的效果。

②从TargetScanHuman上，我们可以发现，miR-21预期的靶位点上没有AP1和VEGF，然而我们的实验结果却显示，miR-21对AP1和VEGF具有调节作用，这提示miRNAs的作用可能是网络式的，具有一定的协调作用，单独的研究某一个miRNA可能具有一定的孤立性。

　　在本实验中的重要发现之一是miR-21在T24人膀胱癌细胞中对AP1和VEGF具有明显的调节作用，过表达的miR-21能够促进AP1和VEGF的表达;我们的进一步实验还发现，miR-21高表达质粒组的T24细胞增殖速率受到了不同程度的促进。

研究microRNA对某些特定基因的调节作用，对于我们进一步阐明发病机制开拓了新的领域。

通过调节某些关键性的microRNA从而实现调控某些膀胱癌关键基因的目的，是膀胱癌疾病研究的重要突破，为临床上针对膀胱癌疾病寻找以microRNA为靶标的新型药物提供理论依据。

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