Ips人工诱导多能干细胞研究报告综述.docx

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Ips人工诱导多能干细胞研究报告综述

Ips人工诱导多能干细胞研究综述

一．摘要

通过导入特定的转录因子可将分化的体细胞重编程为诱导性多能干细胞,这项技术避免了干细胞研究领域的免疫排斥和伦理道德问题,是生命科学领域的一次巨大革命。

与胚胎干细胞一样,iPS细胞能够自我更新并维持未分化状态。

在体外,iPS细胞可定向诱导分化出多种成熟细胞，因此,iPS细胞在理论研究和临床应用等方面都极具应用价值。

iPS细胞的分化和移植在治疗血液疾病中有很大的用途，iPS细胞可治疗神经系统疾病，提供体外的疾病模型，为研究疾病形成的机制、筛选新药以及开发新的提供了新的治疗方法。

利用iPS细胞作为核供体细胞，同适当的受体细胞融合后便可以直接获得转基因动物。

不仅可以提高动物的遗传本质，而且可以打破物种的界限，获得用传统的交配方法无法得到的动物新性状。

iPS细胞的研究一直受到人们广泛的关注,是目前细胞生物学和分子生物学领域的研究热点。

论文对ips细胞的定义，iPS细胞的获得，发展史，研究的意义，研究进展，iPS细胞的应用，面临的问题进行了综述，最后对iPS细胞就行了展望。

关键词：

诱导性多能干细胞胚胎干细胞 转录因子

二．引言

1、历史背景

上世纪八十年代小鼠ESC被成功分离和细胞体内重编程概念的建立，使再生医学得以建立和发展。

由于胚胎干细胞有多向分化能力，可以有效修复退化的或是受损的组织，治疗一些疑难杂症。

但是，基于胚胎干细胞的临床治疗面临着两个问题：

1）植入异体胚胎干细胞可能导致机体的排异反应；2）每一个用于治疗的胚胎都有潜在发育成个体的能力，涉及到伦理问题。

iPS细胞的出现有希望使这两个问题得以解决。

iPS细胞研究的重要历程2006年8月，Takahashi和Yamaaka将小鼠的成纤维细胞诱导为iPS细胞。

次年11月，他们又利用4种同样的转录因子将人的皮肤成纤维细胞诱导为iPS细胞j。

2007年12月，Thomson等人筛选出了另外一套用于诱导的基因组合Dc、Sox2、Nanog和Lin28。

.随后，他们利用这4种因子使人类新生儿成纤维细胞重构为iPS细胞。

这两项发现分别被《自然》和《科学》杂志评为2007年第一和第二大科学进展。

2008年4月，Schemes+Lyland等将鼠皮肤细胞重编程为iPS细胞,并成功地使其分化成心肌细胞、血管平滑肌细胞及造血细胞。

2009年2月，Et本东京大学研究人员在培养iPS细胞的时候添加人类骨髓细胞以及催进细胞增殖的蛋白质等物质使iPS细胞分化成了血小板的前身巨核细胞，进一步培育出血小板，同时也从技术上说明了用iPS细胞培育人类红细胞和白细胞都是可能的。

2010年3月，iPS细胞研究相继迎来两项重大突破。

3月1日，Nagy研究组和Kaji小组采用转座子介导的方法高效率制备了virus-flee鼠iPS细胞，获得iPS细胞后，又成功将先前导入的转录因子基因从iPS细胞中移除。

3月6日，Jaenisch小组将移除外源基因的人iPS细胞成功诱导成多巴胺神经元，且神经元细胞的基本功能不受影响。

2.iPS细胞的概述

IPS细胞是通过导入特定的转录因子可将分化的体细胞重编程为诱导性多能干细。

特定的转录因子为Oct4,Sox2,c-Myc和Klf44个因子（这4个因子也称为Yamanaka因子）可以有效地将胎鼠成纤维细胞（mouseembryonicfibroblast,MEF细胞）和小鼠尾尖成纤维细胞诱导形成形态和生长特点类似ES细胞的克隆,即iPS细胞。

iPS细胞还可让普通体细胞“初始化”，使其具备干细胞功能。

“iPS细胞”具有和胚胎干细胞类似的功能.不需要制造胚胎，就可以从任何组织的细胞，甚至皮肤组织的细胞，制造出具有干细胞功能的细胞。

iPS细胞和胚胎干细胞除了能生成胚胎以外，还可以产生所有的细胞，如果用于医疗，那么理论上可以治愈所有疾病—凡是不好的组织都去除，替换为重新生长的正常组织。

3.IPS细胞的获得

Ips细胞可定向表达胚胎干细胞某些特定的标志基因，与胚胎干细胞一样具有发育全能性。

目前获得iPS细胞的方法有多种，主要包括以下几个方面：

①体细胞核移植：

将体细胞核导入到去核的卵母细胞,使体细胞核在去核的卵母细胞重新编程而获得类似于ES细胞的发育多能性。

②细胞融合：

将哺乳动物的成年体细胞和具有多能性的ES细胞融合可产生四倍体细胞，这种四倍体细胞具有发育的多能性。

③体细胞核直接重编程：

即将Oct4,Sox2,Klf4andc2Myc四种转录因子通过病毒或质粒载体导入到体细胞中，使体细胞核重编程而获得发育的多能性。

④细胞培养：

将生殖细胞置于特定培养条件下进行培养，可使生殖细胞重新编程变成多能性细胞。

由此可见多能性诱导因子可能在维持类似于胚胎干细胞的多能性中起非常重要的作用。

4.研究iPS细胞的意义

成功建立iPS细胞后，应用iPS细胞来治疗疾病是人们的最终目标。

iPS细胞不仅可用于分化和移植，还可以提供体外的疾病模型，以便于研究疾病形成的机制、筛选新药以及开发新的治疗方法。

人类iPS细胞的建立被公认为2007年最重要的科技进展之一,这项技术不仅可以从体细胞建立个体特异的多能干细胞系,解决了细胞移植治疗中的免疫排斥问题,而且为研究人类细胞的重编程的机理以及研究个体特异的疾病发生机理提供了有力的方法。

在干细胞研究领域,iPS细胞技术的出现无疑是具有里程碑意义的突破,多种体细胞经过体外培养和诱导均可转变成为具有多向分化潜能的干细胞,并且证明了几种已知的转录因子可以使已分化的体细胞逆转为未分化的状态,表明细胞的巨大可塑性。

三．iPS细胞的研究进展

体细胞核移植或细胞融合可以重编程高度分化的体细胞,细胞重编程是指将成熟的细胞由分化的状态被逆转到一种未分化状态的过程有研究显示小鼠胚胎早在2-细胞期到4-细胞期的时候,各个卵裂球很可能就已经体现出了不同的发育倾向。

此后,细胞即向着不同的方向不断地发生分化。

无论细胞分化的程度如何,它们与未分化细胞在基因组成上都是一样的。

然而,在其发育过程中,它们的基因组发生了许多表观遗传修饰,说明在卵母细胞以及ES细胞内可能含有一些可以启动细胞重编程的因子,可诱导体细胞表观遗传发生变化而重新获得发育多潜能性,就像受精卵那样重新开始分裂发育。

iPS细胞的来源全部取自体细胞。

2006年这一概念第一次被提出时，山中伸弥使用的是小鼠表皮成纤维细胞和尾尖成纤维细胞。

2007年，成人皮肤成纤维细胞也被成功诱导成iPS细胞。

后来的研究中，以成纤维细胞为细胞源最为常见。

2008年，从成年小鼠的肝脏和胃细胞诱导iPS细胞也获得了成功。

在小鼠中，最常用的是表皮成纤维细胞和尾尖成纤维细胞，也有神经细胞、肌肉细胞、间充质干细胞等，2009年成熟的B细胞和T细胞也获得成功。

人类中新生儿的包皮、口腔黏膜、成人真皮最为常用，角质细胞、间充质细胞、脐带血细胞等也有应用。

有学者证明任意的体细胞都有被诱导成iPS细胞的能力，与细胞种类及人的年龄、性别等没有关系。

但是，iPS细胞的诱导产出率和培养方式与细胞种类是有关的。

后来，iPS技术在其他如大鼠、狗、兔子等物种中也获得了成功，有人因而提出了iPS可以保护濒危物种的说法。

1.细胞因子的作用

传统的iPS技术要在目标细胞中导入四个细胞因子：

Oct3/4，Sox2，Klf4，c-Myc（即OSKM）。

山中伸弥首先筛选出24个与维持ES细胞干性有紧密联系的细胞因子，将它们全部转入体细胞并诱导出iPS细胞，然后进一步减少转入因子的个数，最终确定了必须将以上四个因子同时转入才能成功。

但是，考虑到临床应用前景，四个细胞因子之一的c-Myc作为一个癌症因子，因成瘤性很强而并不友好。

2008年，山中伸弥团队通过改进细胞培养条件，在只转入Oct3/4，Sox2，Klf4三个因子的情况下，也得到了iPS细胞，且获得iPS细胞在所有细胞中的比例大大提高，质量也优于转入四个因子的情况。

[7]两种iPS细胞植入小鼠体内后，有c-Myc的小鼠有6%死于癌症，而没有c-Myc的小鼠无一死亡。

这一方法的唯一问题是c-Myc会使iPS产量大幅提高，该基因的缺失使原本就存在产量不足问题的iPS细胞更难以投入临床应用。

然而，这一问题在今年年初受到了中国一个团队的质疑。

他们观察到在敲除了c-Myc后iPS细胞的产量反而提高了。

该团队分析认为表观遗传改变要积累到一定程度才能顺利推动基因重编程，之前所认为的c-Myc的缺失导致细胞产量低是因为细胞增殖缓慢，而体细胞一味地增殖会影响表观遗传的改变，反而不利于iPS细胞的生成。

因此，对早期体细胞增殖的抑制，可能更利于iPS细胞的产出。

当然细胞培养环境也有影响，有报道称高糖低氧环境更有利于iPS细胞的产生。

2011年，美国有学者提出了用miRNA的方法诱导iPS细胞，他们分别对小鼠和人进行了实验，将mir302/367转入体细胞，miRNA可以激活Oct4和Sox2而无须加入任何的转录因子，同样可以获得iPS细胞，其多能性标记的表达和畸胎瘤的形成等性能都与OSKM获得的iPS细胞类似，对于小鼠还制成了嵌合体并植入生殖系统。

[11]另外他们发现同时加入丙戌酸钠抑制Hdac2通路，可以更进一步提高iPS细胞产量。

2013年2月，又有德国学者提出只要抑制CD47膜蛋白，而无需其它任何基因或基因产物同样可以得到iPS细胞。

原因是CD47的下调会导致c-Myc表达上升同时调控其它与干细胞有关的转录因子，从而得到iPS细胞。

但该文章中并未提到c-Myc作为癌症基因，其表达量的上调会对机体造成的影响。

另外，近年来也有许多学者找到了一些其它细胞因子来代替OSKM，也有提出用激活wnt通路的方法作为代替的。

可见获得iPS细胞的方法也不是唯一的。

但总体来说，为获得iPS细胞，各重编程因子的平衡表达对iPS细胞的产出效率和质量很重要。

研究表明，Oct3/4会增加重编程效率，而SOX2，Kfl4和c-Myc的高表达则会相对降低重编程效率。

2.高效快速建立iPS细胞

我国科学家从羊水细胞中快速建立人类iPS细胞。

继前不久在世界上首次得到完全由诱导多能干细胞（即iPS细胞）发育的小鼠之后，我国科学家在iPS细胞研究领域又取得重大进展：

首次从孕妇产前的羊水细胞中高效快速建立iPS细胞，所需时间只有6天，为目前人类iPS细胞相关报道中最短。

最近在线发表于国际权威杂志《人类分子遗传学杂志》上的这项成果，是由中科院上海生命科学院／上海交大医学院健康科学研究所金颖研究员带领的干细胞研究组与上海新华医院陈方教授合作完成的。

据金颖研究员介绍，此前科学家已经成功地将小鼠、大鼠、猕猴、猪和人的体细胞诱导成为iPS细胞，诱导技术也产生了巨大革新，如减少外源转录因子的种类，使用非整合病毒，质粒法等等。

“目前关于人类诱导多能干细胞的研究还处于起步阶段，所采用的供体细胞还仅仅局限在人包皮成纤维细胞、表皮细胞、毛囊细胞等少数细胞类型。

更为棘手的是，这些细胞被重编程为iPS细胞所需要的时间比较长（通常为16～35天），且效率很低，这大大增加了在个过程中细胞的变异风险。

”金颖说，“因此，如何找到一种理想的人类体细胞来源，是全世界科学家的重点关注课题。

”据介绍，博士研究生李春亮等在金颖研究员指导下，从孕妇产前诊断时剩余的羊水细胞中发现一部分特殊类群，它们在病毒介导的四种因子诱导下，感染后第二天发生形态上的显著变化，第四天出现人胚胎干细胞类似形态的克隆，第六天就可以挑选后进行建系。

研究人员对建立的8株人类诱导多能干细胞进行进一步鉴定后发现，这些细胞能够长期在体外稳定传代并保持体外长期传代核型正常，维持自我更新，蛋白和转录水平高表达全能性的标志基因。

诱导多能干细胞的主要应用是分化和细胞移植。

研究人员按照国际标准尝试了羊水细胞来源的iPS细胞的体外、体内分化潜能，结果发现，iPS细胞能够分化成包括神经前体细胞在内的各种人体细胞。

3.iPS细胞的安全性

iPS研究先驱日本京都大学教授山中伸弥教授带领团队在新一期《自然·生物技术》杂志上报告说，动物实验证明，用不同种类的体细胞培育出的诱导多功能干细胞（iPS）移植后使实验鼠出现肿瘤的危险性存在很大差异。

研究人员分别利用小鼠胚胎的皮肤细胞、成年小鼠的胃细胞、尾巴的皮肤细胞以及肝脏细胞培育iPS细胞。

利用不同的体细胞和培育方法，研究人员共培育出36种iPS细胞。

接着，他们又使这36种iPS细胞都分化成具备演变成神经能力的细胞，并把这些细胞植入另一些实验鼠的大脑。

结果显示，被植入分化细胞来自成年小鼠尾巴皮肤细胞的实验鼠中有83％体内出现了肿瘤；被植入分化细胞来自于小鼠胚胎皮肤细胞的实验鼠中只有8％出现肿瘤；而如果实验鼠移植的分化细胞来自成年小鼠的胃细胞，其体内没有出现肿瘤。

研究还发现，利用含有癌症基因的体细胞培育iPS，对肿瘤的发生几率并无显著影响。

诱导多功能干细胞能分化生成各种组织细胞，同时又回避了伦理问题，被视为未来再生医疗的重要材料。

上述研究表明，确保iPS细胞对治疗的安全性，最重要的是选择何种体细胞作为培育iPS细胞的原料。

4.iPS细胞的应用

（1）iPS细胞在治疗血液疾病的应用

Xu等将iPS细胞诱导分化为内皮前体细胞，然后移植到患有血友病小鼠的肝脏中，使病鼠出血不止的症状得到了有效地改善。

Hanna等人将患病小鼠尾尖成纤维细胞重编程为iPS细胞，然后通过同源重组的方法用人野生型pA.珠蛋白基因替代了pass珠蛋白基因,接着把遗传修饰后的iPS细胞定向分化为造血祖细胞（HPs）,并将纯化后的HPs移植入hps/llps雄性小鼠中，Has有效地抑制了镰刀形红细胞贫血症症状。

日本用人类iPS细胞制成血小板，日本东京大学干细胞生物学教授中内启光最近成功地用人类诱导多功能干细胞（iPS细胞）培养出血小板，这在世界尚属首次。

中内启光等研究人员采用与日本京都大学教授山中伸弥同样的方法．向人类皮肤细胞植入基因，制成iPS细胞。

在培养iPS细胞时，研究人员添加了人类骨髓细胞以及促进细胞增殖的蛋白质等物质结果iPS细胞分化成了血小板的前身巨核细胞；之后，巨核细胞进一步分化成血小板。

血小板是哺乳动物血液的重要成分之一，具备收缩血管，形成止血栓，帮助止血等功能。

手术中使用的血小板现在主要通过献血采集，在这种情况下血小板只能保存几天，十分不便。

研究人员说．这项研究成果也表明，从技术上来说．用iPS细胞培育人类红细胞和白细都是有可能的。

（2）体细胞核移植技术

利用iPS细胞作为核供体细胞，同适当的受体细胞融合后便可以直接获得转基因动物。

因此，将iPS细胞诱导技术同动物转基因技术相结合不仅可以提高动物的遗传本质，而且可以打破物种的界限，获得用传统的交配方法无法得到的动物新性状。

2010年，中国的两个研究团队在世界上首次建立了猪的iPS细胞系，填补了小鼠与人之间的空白。

中国科学院广州生物医药与健康研究院裴端卿研究

团队从西藏微型猪的胚胎中分离成纤维细胞，再用逆转录病毒将转录因子导入成纤维细胞中，成功诱导了猪的iPS细胞系Il”。

中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所肖磊研究小组，运用可诱导（Tet-on／of系统）的慢病毒表达系统表达转录因子把猪成体细胞成功地重编程到多能干细胞状态，经过进一步筛选、鉴定，最终也获得符合多能干细胞标准的猪iPS细胞系ll。

这是世界首次培育出驯化的有蹄类动物的多能干细胞。

猪在生理上与人的差异相对较小，因此，猪iPS细胞的建立具有重要意义：

第一，我们可以使用诱导干细胞修改猪的与免疫有关的基因，从而让猪的器官与人类免疫系统兼容；

第二，许多人类疾病是由基因表达障碍造成的，我们可以修改干细胞中猪的基因，并培育出携带同样基因障碍的猪，然后使用这种猪模型开发治疗这种疾病的法；

第三，利用iPS技术培育出一种准确的转基因猪，改善它对某种疾病的耐性，从而改善畜牧业。

目前，在牛、羊等其它大家畜中尚无这方面的报道，如果我们能够建立这些动物的iPS细胞，并应用其来生产基因打靶或转基因动物，必然会提高转基因动物的效率，为转基因研究开创一片更加广阔的天地。

（3）治疗神经系统疾病

Wemig等人将iPS细胞分化为神经前体细胞，然后把这些细胞移植入胎鼠脑中，它们可整合到受体鼠的脑中，13.5d后形成神经胶质细胞和神经元细胞，包括谷氨酰胺能神经元、GABA能神经元、儿茶酚胺能神经元细胞。

将由小鼠iPS细胞在体外诱导分化来的多巴胺能神经元移植进帕金森病大鼠模型脑内，一段时间后可有效缓解大鼠疾病症状和改善其行为。

最近，利用帕金森症患者的皮肤细胞培育出iPS细胞后，又成功将其分化为多巴胺神经元细胞，这是帕金森症患者大脑中所缺少的一种重要细胞。

因此，其有望成为治疗帕金森症的一种方法。

美国科学家成功培养出iPS细胞用于制造神经元。

研究小组在iPS细胞的培养过程中采用了日本京都大学再生医学研究所的山中伸弥教授等确立的方法，即用逆转录病毒载体，将KLF4、SOX2、OCT4、c—MYC四种因子导入细胞。

在检查培养的iPS细胞和患者是否携带相同基因变异的同时，也考察了基因表达谱和抗原一抗体反应谱，据此确认所得到的iPS细胞是ES细胞样细胞。

iPS细胞分化为运动性神经元和神经胶质细胞的程序，借用了小鼠和人细胞诱导分化的做法。

虽然因使用逆转录病毒载体可能将外源基因在多处随机导入，但不会对诱导分化产生影响。

经过诱导分化处理之后，已经确认在运动性神经元细胞有特异性转录因子的表达及在运动性神经元发生时发挥作用的转录因子等的表达。

iPS细胞来源的运动性神经元，在脊髓上表达了与处于生长阶段的运动性神经元类似的前体细胞标记。

另外，即使在分化成神经胶质细胞的细胞上．也能够确认神经胶质细胞特异性标记物的表达。

5.iPS细胞面临的问题

经过了近5年既漫长又短暂的发展，iPS细胞技术已经取得了举世瞩目的进展。

一个个突破性的成果既给我们带来了喜悦，也带来了新的挑战，细胞重编程有望迎来一个新的研究浪潮。

尽管iPS细胞有着诱人的应用前景，然而，未来iPS细胞的研究也面临着许多亟需解决的问题：

第一，效率问题。

目前，诱导产生iPS细胞的率仍然很低，这与基因导人的方式整合位点、表观遗传学等多种因素有关。

这已成为制约iPS从实验室走向临床的最大瓶颈。

因此，如何提高iPS细胞的制备效率仍是人们普遍关注的问题。

第二，安全性问题。

现在诱导iPS细胞通常借助逆转录病毒为载体，将几种癌基因转入分化细胞诱导其成为iPS细胞，而这种方法就有可能会因为外源基因插入细胞基因组，干扰了内源基因的表达，从而诱发癌症。

第三，机制问题。

细胞的多能性受到转录因子网络和表观遗传学的复杂调控，那么，仅仅依靠导人的几个转录因子是如何完成这一复杂的任务，从而诱导出具有多能性的细胞呢?

深入研究体细胞重编程的分子机制，调控机制以及体外定向诱导分化机制也是未来研究的重要任务之一。

第一，逆转录病毒和慢病毒载体导致肿瘤发生的潜在风险需要加以有效防范。

第二，需要深入研究比较iPS细胞和hES细胞在细胞生物学特性、定向分化机制等方面是否具有显著的差异。

第三，需建立一种新的方法以避免基因转染或基因转导带来的潜在风险,如通过某些化学药物或因子激活体细胞中固有的上述转录因子的方式以替换外源性基因转染的方式,或者用某些因子的短暂性表达代替永久性导入。

第四，提高制备iPS细胞的效率。

需指出的是,iPS细胞研究的突破并不意味着ES细胞研究的衰亡,因为iPS细胞所使用的转录因子正是来源于ES细胞长期研究的积累。

6.小结

IPS细胞之所以引起人们的兴趣，是因为它解决了免疫排斥问题，并避免了伦理道德的制约，使实现细胞替代治疗又近了一步。

但是，由于它自身的安全性问题，目前IPS细胞还无法应用于临床治疗，但总的来说，iPS技术的确是一项开天辟地的成就，为再生医学的发展和疑难杂症的治疗带来的新希望。

但是，这项技术离临床治疗还有很长的距离要走，最重要的一点就是要保证细胞的安全性。

如果这一问题得以解决，细胞和基因治疗将在为来有更广阔的发展前景。

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