农杆菌转化法中的导入和筛选释疑.docx
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农杆菌转化法中的导入和筛选释疑
农杆菌转化法中的导入和筛选释疑
农杆菌转化法是教学中的重点和难点，教材中没有具体的知识介绍，考试中经常会出现，因些也是高频考点。
以前一直以为农杆菌转化过程中的筛选应该是根据大肠杆菌筛选的办法，即通过抗生素选择培养基筛选已经导入重组DNA的农杆菌，其实不然。
另外，导入植物细胞的不是完整的重组DNA分子，而是T－DNA片段。
问题：
农杆菌转化法过程中是如何筛选的？
T－DNA片段有什么特点？
01
试题：
（2019·浙江七彩阳光联考）某研究小组欲利用抗虫基因，通过农杆菌转化法培育抗虫玫瑰。
图甲和图乙分别表示抗虫基因和农杆菌Ti质粒的限制性核酸内切酶的识别位点和抗生素抗性基因（Pst、Sma、Alu表示限制性核酸内切酶切割位点；ampr为氨苄青霉素抗性基因，tet为四环素抗性基因）。
请回答下列问题：
（1）为获得大量抗虫基因，且保证形成重组质粒时，目的基因以唯一方向接入，可选用 （填限制酶的种类）分别切割目的基因和Ti质粒，再用DNA连接酶连接，形成重组DNA分子，再与经过 处理的 （A.有ampr和tet B．有ampr，无tet C．无ampr，有tet D．无ampr和tet）农杆菌液混合，使重组DNA进入农杆菌，再利用农杆菌将重组DNA转入培养的玫瑰细胞，使目的基因导入玫瑰细胞中。
（2）将含有导入了目的基因的玫瑰细胞的试管放在 上，进行液体悬浮培养，获得胚性细胞，进而培育成抗虫玫瑰。
（3）这种借助基因工程方法，将外源基因导入受体细胞，再通过将这些转基因细胞进行培养，获得具有特定性状的新植株的技术就是 。
答案：
（1）Sma和Pst CaCl2 D
（2）摇床 （3）植物细胞工程技术
解析：
该试题有多个亮点，一是双酶切法就是防止质粒和目的基因自身环化并保证目的基因单向插入质粒；二是CaCl2处理后能让细菌处于感受态，利于导入重组质粒；三是筛选过程用到了双抗，即不能抗四环素，能抗氨苄青霉素的细胞说明已经导入目的基因；四是出现了浙科版教材特殊的植物细胞工程技术概念。
但是试题有个值得商榷的地方是，选择题的答案为D，而学生根据惯性思维或者按照试题的信息选择的可能是B，选择D的原因是受体农杆菌必须是无抗性的，而根据我了解的情况农杆菌转化法的筛选是转化的植物细胞。
（1）为获得大量抗虫基因，且保证形成重组质粒时，目的基因以唯一方向接入，可选用Sma和Pst分别切割目的基因和Ti质粒，再用DNA连接酶连接，形成重组DNA分子，此时的重组DNA分子中的标记基因为ampr，再与经过CaCl2处理（使其成为感受态细胞）的无ampr和tet的农杆菌液混合，使重组DNA进入农杆菌，再利用农杆菌将重组DNA转入培养的玫瑰细胞，使目的基因导入玫瑰细胞中。
（2）将含有导入了目的基因的玫瑰细胞的试管放在摇床上，进行液体悬浮培养，获得胚性细胞，进而将其培育成抗虫玫瑰。
（3）这种借助基因工程方法，将外源基因导入受体细胞，再通过将这些转基因细胞进行培养，获得具有特定性状的新植株的技术就是植物细胞工程技术。
02
整个转基因体系的建立步骤大致可以归纳为：
目的载体的构建－载体的农杆菌转化－农杆菌与植株共培养－转化植株的筛选－转化植株的鉴定。
在每一步中都涉及到很多的方法与技术。
1．获取目的基因
用限制性核酸内切酶分别切割下目的基因（如抗虫基因）和Ti质粒。
可以采用双酶切，防止自身环化和目的基因单向插入Ti质粒。
2．基因表达载体的构建
将目的基因与载体（Ti质粒）用DNA连接酶连接起来。
农杆菌Ti质粒的特点：
T-DNA是质粒上一段10－30kb的序列,编码5个与致瘤有关的生长素和细胞分裂素合成酶基因。
其左右边界各有一段高度保守的25bp的同向重叠序列与T-DNA的转化有关。
T-DNA的转化是在Ti质粒上Vir区一系列Vir基因的作用下产生的。
质粒还需要对T-DNA进行改造，如连接上抗性基因，因为自然的（野生型）农杆菌质粒是没有抗性基因的的（如图）。
3．将重组DNA分子导入受体细胞（农杆菌）
将含目的基因的重组质粒导入农杆菌, 此农杆菌需要经过CaCl2处理，使其成为感受态细胞。
如果筛选农杆菌有没有导入重组DNA，那么，农杆菌必须是没有抗性基因的，也就是属于敏感型（因为有研究人员提供信息）。
但一般的资料认为是转化植物细胞完成筛选的。
4．植株转化实验
农杆菌与植物细胞的共培养，转化如图。
在溶液中加入促进植株愈伤生长的激素能一定程度提高转化率。
转化细胞的筛选，大多是利用抗生素进行筛选的，抗生素的选择则需根据目的载体确定，如潮霉素抗性基因、卡那霉素和羧苄青霉素抗性基因作标记基因。
筛选通常在植物转化细胞中进行的参考文献是《转基因植物中抗生素抗性基因的安全性评价》（浙大程志强等）。
转化机理示意图
接着，利用抗生素完成脱菌的过程，在共培养之后的选择培养基中附加一定量的羧苄青霉素等，用来抑制农杆菌增殖，从而达到在后续实验中消除转化植物细胞（组织）中农杆菌的作用。
5．植株鉴定
最后将成功表达的细胞通过脱分化和再分化形成植株或直接感染的植物体，对植物体进行个体生物学水平鉴定。
03
影响转化的因素有很多，主要的因素有：
1菌株及载体
遗传转化中常用的农杆菌菌株有3种类型:
胭脂碱型、章鱼碱型和琥珀碱型,菌株选择的合适与否直接影响了最终的转化效率。
另外,菌株和载体的组合对转化至关重要。
2.Vir基因的活化
酚类物质或酚类物质含量低而不能诱导Vir基因的活化。
另外,在共转化其间还有许多因素与Vir基因的表达有关,这些因素包括:
酸性pH值、低温培养、高渗透压等。
一些小分子量的糖类如半乳糖、葡萄糖等也能诱导Vir基因的表达。
3.受体材料、生长状况及基因型
不同来源、不同发育状态和不同基因型的受体材料对农杆菌的敏感性虽然不尽相同,但保持旺盛的细胞分裂和DNA复制是T-DNA整合所必需的。
4.培养基成分
除基本培养基外,根据农杆菌转化的机制,一般还在培养基中加一些特殊组分来提高农杆菌的附着能力、Vir基因的活性和受体材料的感受态。
5.选择性标记基因
除了有效的遗传转化以外,高效的选择标记系统也是农杆菌转化所必须的。
除以上几个主要的影响因素以外,还有一些因素也影响转化农杆菌转化的效率。
如农杆菌的生长状态、菌液浓度、侵染方式、共培养时间和温度、pH值、超声波、表面活性剂等。
04
关于植物细胞工程概念，是浙科版教材特有的，教材中有专门的表述：
也就是包含了基因工程、原生质体的培养等技术在内的工程，可以用以下表述式来理解：
05
试题1：
（2016·4月浙江选考节选）兔肝细胞中的基因E编码代谢甲醛的酶，拟利用基因工程技术将基因E转入矮牵牛中，以提高矮牵牛对甲醛的代谢能力，请回答：
从兔肝细胞中提取mRNA，在 酶的作用下形成互补DNA，然后以此DNA为模板扩增得到基因E。
在相关酶的作用下，将基因E与Ti质粒连接在一起，形成 ，再导入用氯化钙处理的 ，侵染矮牵牛叶片。
解析：
mRNA在逆转录酶的作用下形成互补DNA。
将基因E与Ti质粒连接在一起，形成重组DNA分子。
重组DNA分子可导入用氯化钙处理的农杆菌细胞，再用处理的农杆菌侵染矮牵牛叶片，从而使基因E整合到矮牵牛细胞的染色体DNA上。
答案：
逆转录 重组DNA分子（重组质粒） 农杆菌
试题2：
在应用农杆菌侵染植物叶片获得转基因植株的常规实验步骤中，不需要的是（ ）
A.用携带目的基因的农杆菌侵染植物细胞
B.用选择培养基筛选导入目的基因的细胞
C.用聚乙二醇诱导转基因细胞的原生物质融合
D.用适当比例的生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织生芽
解析：
农杆菌转化法是基因工程中常用的将目的基因导入植物细胞的方法，A正确；筛选含目的基因的受体细胞，可以在选择培养基上针对标记基因进行，B正确；在应用农杆菌侵染植物叶片获得转基因植株的过程中没有涉及原生质体融合，C错误；获得含目的基因的受体细胞后还要经过植物组织培养过程才能得到转基因植物，在植物组织培养过程中需要调整培养基中的生长素和细胞分裂素浓度配比，诱导其完成脱分化和再分化进程，D正确。
故选C。
试题3：
（2018·浙江4月选考节选）回答与基因工程和植物克隆有关的问题：
（1）将含某抗虫基因的载体和含卡那霉素抗性基因的载体pBI121均用限制性核酸内切酶EcoRⅠ酶切，在切口处形成 。
选取含抗虫基因的DNA片段与切割后的pBI121用DNA连接酶连接，在两个片段相邻处形成 ，获得重组质粒。
（2）已知用CaCl2处理细菌，会改变其某些生理状态。
取CaCl2处理过的农杆菌与重组质粒在离心管内进行混合等操作，使重组质粒进入农杆菌，完成 实验。
在离心管中加入液体培养基，置于摇床慢速培养一段时间，其目的是 ，从而表达卡那霉素抗性基因，并大量增殖。
解析：
（1）构建重组质粒时限制性核酸内切酶EcoRⅠ剪切得到的是粘性末端，DNA连接酶连接两个DNA片段之间形成的是磷酸二酯键。
（2）目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法。
用Ca2＋处理细菌以增加细菌细胞壁的通透性，让其处于感受态细胞，以利于重组质粒导入。
答案：
（1）粘性末端 磷酸二酯键
（2）转化 使CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态
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