Transwell实验 超详细.docx

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Transwell实验超详细

Transwell侵袭实验总结之杨若古兰创作

第一节概念

这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型.

关于Transwell这个词该如何解释，查了很多材料也未见精确的注解，我觉得可以这么理解吧，trans这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的安装，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membranefilters），也可认为是一种有通透性的支架（permeablesupports）.

更精确地说，Transwell应当是一种实验技术，这项技术的次要材料是Transwell小室（Transwellchamber，Transwellinsert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，分歧厂家对Transwell会有分歧的命名，而分歧型号也可有分歧外形，分歧大小，根据实验须要，可有分歧选择.

但不管是何种外形，其关键部分都是分歧的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样.这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据分歧须要可用分歧材料，普通经常使用的是聚碳酸酯膜（polycarbonatemembrane）.

下图是一个Transwell安装的纵切面

将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装基层培养液，上基层培养液以聚碳酸酯膜相隔.

我们将细胞种在上室内，因为聚碳酸酯膜有通透性，基层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研讨基层培养液中的成分对细胞生长、活动等的影响.

利用分歧孔径和经过分歧处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研讨.

上面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然分歧细胞其体积分歧，具体选择时要考虑到细胞大小.这里次要谈几种大家经常使用的实验：

（1）共培养体系：

小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，是以，若研讨不涉及细胞活动能力，不须要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径.经常使用0.4、3.0µm.我们实验室用的是0.4µm.

将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研讨细胞B分泌或代谢发生的物资对细胞A的影响.

（2）趋化性实验

可用5.0、8.0、12.0µm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力.

①细胞B对细胞A的趋化感化：

将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研讨细胞B分泌或代谢发生的物资对细胞A的趋化感化.

②趋化因子对细胞的趋化感化：

将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研讨该趋化因子对细胞的趋化感化.

（3）肿瘤细胞迁移实验

经常使用8.0、12.0µm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向养分成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力.

（4）肿瘤细胞侵袭实验

经常使用8.0、12.0µm膜，道理与肿瘤细胞迁移实验类似.

上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向养分成分高的下室跑，但与肿瘤细胞迁移实验分歧的是，聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜.计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力.

用于研讨肿瘤细胞侵袭能力的肿瘤细胞侵袭模型有如下几种（引自司徒镇强《细胞培养》）：

2.1体内癌细胞侵袭模型

2.1.1皮下移植侵袭模型

2.1.2肌肉内移植侵袭模型

2.1.3腹腔内移植侵袭模型

2.1.4小鼠肾包膜下移植侵袭模型

2.1.5鼠睾丸包膜下移植侵袭模型

2.1.6小鼠耳廓皮下移植侵袭模型

2.1.7鼠爪垫皮下移植侵袭模型

2.1.8视网内界膜侵袭模型

2.2体外癌细胞侵袭模型

2.2.1体外静止器官培养法

2.2.1.1半固体培养基单细胞器官培养法

2.2.1.2液体培养基单细胞器官培养法

2.2.2半体外半体内器官培养法

2.2.3单层细胞器官培养法

2.2.4瘤细胞球体器官培养法

2.2.4.1静止球体器官培养法

2.2.4.2扭转动摇球体器官培养法

2.2.5单层细胞侵袭实验模型

2.2.6Transwell侵袭小室测定法

可见，Transwell与侵袭实验之间其实不克不及划等号，Transwell有多种利用，侵袭实验也有多种方法.所谓Transwell侵袭实验，其实是指将Transwell这一技术利用于肿瘤细胞侵袭研讨的一种实验.因为其简单易行、反复性好，因此得到了愈来愈广泛的利用，但不克不及认为研讨肿瘤侵袭只要Transwell一种方法.

第二节Transwell侵袭实验

我的课题涉及Transwell侵袭实验和Transwell迁移实验，其他方面的Transwell利用我不太清楚，是以这里次要谈谈Transwell侵袭实验.

1.实验用品：

①Transwell小室：

多种厂家可提供，论坛里经常使用的是Costar、Corning、BD生产的小室，我们实验室用的是Chemicon公司的ECM550系列，另有Boydenchamber、Millipore公司的millicell和雕弓满月射天狼战友介绍的Thincert.

这些厂家提供的小室，有的已铺好基质胶，买来就可以用，很方便，但也比较贵，我们实验室用的Chemicon公司的ECM550系列是曾经铺好胶的，质量很好，但是非常贵，24孔板配套的小室，每个价格约130元，不推荐给大家.BD也有已包被好的，价格不清楚.Coster和Corning公司生产的小室，是论坛里比较经常使用的，好像是要本人铺胶，但据说每个小室成本只要40摆布，应当比较适合中国国情.

上面是一些战友提供的价格，具体建议大家联系代理商征询.linanping1979战友提供的价格：

coster的24孔板的transwell的价格是456元RMB,8µm，用于肿瘤的侵袭实验.iceyxy战友提供的价格：

Millipore的8µm的50个1760RMB,0.4µm的2000多,是一次性的.梅林战友提供的BD价格：

240RMB一块（6.5um,24孔,12instert），好像是没胶的.liguofan说国产的boyden30块一个.jjyy提供的价格是：

corningcatNo.3422.6.5mmtranswellwith8.0umprorepolycarbonatemembraneinsert,Qty48,950人民币不到.平均每个20元不到.

Transwell小室按照公司的请求，都是一次性使用的.不过其实洗洗泡泡还是可以反复用的.我用的Chemicon公司的ECM554，用完后擦去基质胶，再用胰酶和75%酒精泡，可以把膜洗得很干净，用前用紫外里外都照30min.sword01战友提供的处理方法：

用棉签轻轻擦去胶和反面细胞，清水冲洗，超声清洗，低挡，30min，清水3×5min，蒸馏水3×5min，室温凉干，用前紫外线小室正面3h，反面6h，微波，低火10min×2.

因为我买的是铺好胶的，所以没买Matrigel，二次利用的小室只用来做不须要铺胶的迁移实验.之前的ChemiconECM550系列，膜很结实，擦不坏，可以反复用很多次，但此刻的膜曾经改用一种很薄很脆的材料，普通只能反复用一次，真黑啊！

很多战友说Costar和Corning也是可以反复用的，大家可以试试.

本人没见过，有爱好的可以本人研讨一下.

另外，根据论坛战友提供的信息，osmonic公司有公用的膜出售，鼎国生物代理.Transwell小室用过后，可把本来的膜切下，贴上osmonic公司的膜，如许又可以用了，不过我没用过，有爱好的可以试试.maojianwen战友的使用方法：

trasnwell小室做一次后，将本来的膜去掉，从头泡酸，泡酒精，使用前照紫外，然后用女士用指甲油（留意用无色较稀的）将osmonic公司的膜贴上，剪掉多余的边沿.再照紫外.

②上层培养液：

上层培养液采取无血清培养基，为保持渗透压，需加入0.05%0.2%BSA.

③细胞：

值得留意的是，有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验.建议实验前先用酶谱法检测MMPs的表达，特别是MMP2的表达.如果不清楚细胞MMPs的表达情况，就盲目进行Transwell侵袭实验，可能会形成不须要的浪费，一次Transwell侵袭实验花钱少则数百，多则数千，其实不是笔小数目，还是当心为妙.

另外，为了让实验结果更明显，可先撤血清让细胞饥饿12－24h，再进行实验.

④基质胶：

经常使用的是人工重构基底膜材料Matrigel，次要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原，生产厂家有BD、美国CollaborativeRsearch公司等.CaoY战友的帖这么说的：

Matrigel是BD公司生产的，是一种细胞外基质，4度时是液体，在37度会逐步凝固成胶状，不成逆.同样的东西在sigma叫ECM.zhangyong1036战友提供的价格：

BD公司的matrigel1500摆布.

如果购买的小室是曾经铺好基质胶的，那么Matrigel就不须要购买了.

⑤基层培养液：

基层经常使用含5%－10%FBS的培养基，具体浓度根据细胞侵袭力而定，侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度.基层也可用趋化因子，有战友将纤维粘连蛋白加入基层培养液作为趋化因子，但个人认为，FBS仍是最合适的.

⑥细胞培养板：

经常使用于Transwell侵袭实验的细胞培养板有6孔板、12孔板、24孔板等，以24孔最经常使用.细胞培养板没什么特殊请求，普通的细胞培养板就可以.但要留意，细胞培养板该当与购买的Transwell小室相配套.

⑦此外，膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白（fibronectin，FN，Sigma有售），如许做的目的是使穿过膜的细胞更好地附着在膜上，也可用胶原（collagen）或明胶（gelatin）.很多战友认为这不是必须的，而且我也是不涂的，细胞照样贴壁很好.如果贴壁欠好的话可以试试看.linanping1979战友认为，如果培养时间很长（>24h），细胞还是会掉到下室里面去，所以有条件的话，最好还是在膜基层涂上FN.

另外，值得一提的是，膜基层涂上FN还有必定的趋化感化.

2．步调

2.1Transwell小室制备

2.1.1无基质胶Transwell小室制备

①包被基底膜：

用50mg/LMatrigel1:

8浓缩液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干.如果须要鄙人室面铺FN的话，可将200ul枪头的尖端剪掉,汲取FN均匀涂抹在小室的上面.用胶原（collagen）的话，一班配成0.5mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上.

②水化基底膜：

吸出培养板中残存液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37℃，30min.

另有tianjin_glioma战友提供的方法：

在上室的聚碳酸酯膜上加入浓缩后的Matrigel（3.9ug/ul）6080µl（留意体积不成太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好），置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶.

2.1.2有基质胶的Transwell小室制备

Chemicon公司的ECM550系列说明书请求，将小室放入培养板中，在上室加入300µl预温的无血清培养基，室温下静置15－30min，使基质胶再水化.再吸去剩余培养液.

2.2制备细胞悬液

①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响.但这一步其实不是必须的.

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬.调整细胞密度至1－10×105，个人认为不要超出5×105.

具体实验时采取密度要本人摸索，因为分歧细胞，其侵袭能力是分歧的.个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最初用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，是以起码也要包管在收样的时候，上室内还要有必定量的细胞存在.

个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差别会严重影响实验结果.如果须要对细胞预处理而不克不及不分开计数，那么计数必定要多反复几次，力求精确，尽量包管对照组和处理组细胞密度分歧.

2.3接种细胞

①取细胞悬液100－200µl加入Transwell小室，分歧公司的、分歧大小的Transwell小室对细胞悬液量有分歧请求，请参考说明书.24孔板小室普通200µl.

②24孔板下室普通加入500µl含FBS或趋化因子的培养基，分歧的培养板加的量有分歧请求，具体请参考说明书.这里要特别留意的是，基层培养液和小室间常会有气泡发生，一旦发生气泡，基层培养液的趋化感化就减弱甚至消逝了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板.

③培养细胞：

惯例培养12－48h（次要依癌细胞侵袭能力而定）.时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理身分对细胞数目的影响也不成忽视.

以我的课题为例，我使用的药物不但会按捺肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显按捺.我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72h的IC50.用这个浓度处理细胞，24h内对细胞增殖并没有明显按捺，但24h后，按捺感化就开始出现了.所以，用这个浓度来做Transwell，处理时间也必须限制在24h内，否则一旦药物按捺了细胞增殖或者引诱出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是因为侵袭被按捺惹起，还是处理后细胞数目本人就比对照组少而惹起的了.

时间过长不成以，同样，过短也不成，因为细胞内会有必定量的MMPs储存，短时间内可能侵袭能力不会有太大改变.同时从药物被接收进去，进而发挥感化，影响MMPs表达，到最初释放到培养基中，还须要一个过程.时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点研讨时间依附效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不克不及有明显变更.

另外，我看到细胞在小室内的外形不是正常培养贴壁的外形，而是圆形的，仍是悬浮时的外形，不过会聚集成团，所以看到细胞不正常贴壁也没关系张，是正常景象

在培养过程中，膜下会逐步有少量吝啬泡发生，这是正常景象，可不予处理，但我碰到过培养一段时间后，膜下出现了大气泡，好在及时发现，否则后果将非常严重.是以，个人建议，最好接种细胞后1－2h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡发生.

2.4结果统计

检测穿过的细胞数有两种方法：

2.4.1直接计数法

2.4.1.1“贴壁”细胞计数

这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去.如下图：

通过给细胞染色，可在镜下计数细胞

①用棉签擦去基质胶和上室内的细胞

②染色：

经常使用的染色方法有结晶紫染色、台肦蓝染色、Giemsa染色、苏木精染色、伊红染色等.

个人推荐采取0.1%结晶紫染色，这类方法有如下上风：

（1）.不须要固定细胞，直接染色即可.

（2）.配制简单方便.（3）.染色后可以用33%醋酸脱色，将结晶紫完整洗脱上去，洗脱液可在酶标仪上570nm测其OD值，间接反映细胞数.个人认为这是结晶紫染色最大的上风所在.因为，虽然经过精确的细胞计数，常常穿过膜的细胞数仍难以精确控制，可能某一批实验穿过的细胞会特别多，乃至细胞成堆，这类情况下就难以计数了，这类情况下就可以用醋酸脱色后用酶标仪检测.使用结晶紫染色要留意，染色前要将膜风干，否则可能会染不上.

③细胞计数：

我们使用的是LeicaDC300F正置显微镜进行观察和拍照，把Transwell小室反过来底朝上就可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞.也有很多人用手术刀将膜切下后染色，再贴在玻片上，滴二甲苯，再盖上盖玻片，就可以持久保管，但是如许做小室就成了一次性的了，不免有点浪费.

取若干个视野计数细胞个数.论坛里普通采取3－5个视野，也有人用10个，都是随机拔取，个人认为如许选择的视野带有很大的偶然性，也会掺进人为影响，特别是计数视野较少的时候.我拔取16个视野，不是随机选择，而是有固定的地位.我们使用的显微镜所看到的视野的直径刚好是Chemicon公司的ECM550系列小室底面膜的直径的1/4.

如图，蓝色部分暗示膜的大小，白色圆形暗示视野的大小，绿色方形则暗示拍照时所能拍下的视野的中间部分.如许，每个小室都拍摄如下图的16个视野进行计数，如许得到结果是比较客观和精确的.

2.4.1.2“非贴壁”细胞计数

因为某些细胞本身的缘由或某些膜的关系，有时细胞在穿过膜后不克不及附着在膜上，而是掉进下室.如下图：

2.4.2间接计数法

间接计数法次要用于穿过细胞过多，而没法通过计数获得精确的细胞数所采取的方法，与经常使用的MTT实验是同样的道理.

2.4.2.1MTT法

①用棉签擦去基质胶和上室内的细胞

②24孔板中加入500µl含0.5mg/mlMTT的完整培养基，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37℃4h后取出.

③24孔板中加入500µlDMSO，将小室置于其中，使膜浸没在DMSO中，振荡10min，使甲臜充分溶解.取出小室，24孔板于酶标仪上测OD值.

2.4.2.2荧光试剂检测

这类方法普通是与Transwell小室一路出售的，其道理与MTT法类似，是用一种荧光染料染细胞，再将细胞裂解，检测荧光值.Chemicon的ECM554即属于这类.

2.4.2.3结晶紫检测

上文已说过，这里不再赘述，道理与MTT法也是类似的.但结晶紫染色还有个长处，就是染色和脱色的过程其实不影响膜上细胞，在脱色后还可从头染色.

这是用正置显微镜拍摄的图，结晶紫染色，进行细胞计数.

第三节Transwell的其他利用的实验步调

1．Transwell肿瘤细胞迁移实验

过程与Transwell侵袭实验基本分歧，分歧的只是不须要铺Matrigel.个人认为，因为没有基质胶的反对，细胞穿过膜的速度较侵袭实验明显加快，所以细胞量要更大.我做侵袭实验的细胞密度是1×105，而迁移实验的密度是1×106.另外，基层培养液的FBS浓度也可适当下调，我做侵袭实验的浓度是5%，迁移实验的浓度是2.5%.

2．cathywxy战友的Transwell上皮细胞培养步调

做了一段时间的原代细胞培养，把经验拿出来跟大家分享一下吧，请有关战友共同探讨：

（1）将雄性wistar大鼠麻醉，开胸，将气管取出，置于4℃含0.1％胰蛋白酶XIV（Sigma），100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素（GibcoBRL）、无Ca2＋、Mg2＋，无血清的MEM.

（2）用无菌的细胞刮棒刮气管内壁，将所得溶液离心后得到游离细胞.

（3）离心后立即用新颖的上述MEM溶液（含10％胎牛血清）清洗3次，以中和胰蛋白酶，再用含5％胎牛血清、100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的LHC8medium（Biofluids）冲洗一次.

（4）冲洗过后，将得到的细胞悬液用台盼兰测定活力，若存活率大于90％，则将细胞以106/cm2密度接种于可通透的多聚碳滤膜上（12mmSNAPWELL,Costar），以37°C5％CO295%空气含5%胎牛血清（GibcoBRL）and100U/ml青霉素and100ug/ml链霉素的LHC8medium孵育6~10天.

（5）孵育后，经测定跨上皮电阻在1000~2000Ω之间，即可用于电生理试验.

显微镜下气管上皮细胞形细胞呈铺路石状，圆形核位于地方，生长时常彼此紧密连接成单层细胞片

3.metastasis战友的TranswellB16细胞的体外迁移实验

我之前用costar的Transwell做过B16细胞的体外迁移实验，具体是这么做的：

首先把Transwell倒置，在Transwell的PVPF膜（0.8um）的下概况涂一层fibronectin（10ug/ml，50ul）,37度2小时，PBS洗一遍后，放入事后每孔加有600ul的培养基（含10%血清）的24孔板内，后在Transwell的内室加入细胞（100ul,用含0.1%血清的培养基浓缩好本人所需密度），放入培养箱，1218小时后，取出Transwell，用棉签擦去PVPF膜靠近内室那一面的细胞，另一面的细胞用甲醛室温固定30分钟，结晶紫染色20分钟，用清水洗3遍以上，后在显微镜下观察细胞，记数.

4．mci战友的内皮细胞HMEC1迁移实验

1%明胶处理的transwell经无血清的MCDB131培液于培养箱中平衡1小时后，上室加入100µl用serumfreeMCDB131浓缩的5*104/孔的HMEC及分歧浓度的药物，下室加入0.6mlserumfree的MCDB131培液及20%FCS刺激迁移,同时设置响应阴性及阳性对照，置于CO2培养箱中感化8小时，然后弃去孔中培液，用90%酒精常温固定30分钟，0.1%结晶紫常温染色10分钟，清水漂净，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，显微镜（Olympus,DP50,Japan）.下观察并拍照，最初用10%乙酸100µl/孔抽提10分钟，于600nm处测定OD值.按捺率计算公式为：

按捺率（%）=[（OD值给药组OD值无刺激阴性对照）/（OD值不加药阳性对照OD值无刺激阴性对照）]×100%.