流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程.docx
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流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程
流式检测细胞凋亡
AnnexinV检测细胞凋亡
实验原理
AnnexinV是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。
它是一种磷脂结合蛋白,可以与早期凋亡细胞的胞膜结合,而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。
在细胞发生凋亡时,膜磷脂酰丝氨酸(PS)由质膜内侧翻向外侧。
AnnexinV与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力,因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。
由于在发生凋亡时,磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变,因此,与DNA碎片检测比较,使用AnnexinV可以更早地检测到凋亡细胞。
因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻,所以AnnexinV常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI或7-AAD)合并使用,来区分凋亡细胞(AnnexinV+/核酸染料-)与死亡细胞(AnnexinV+/核酸染料+)。
实验用品
1.一次性12⨯75mmFalcon试管。
2.PBS缓冲液:
含0.1%NaN3,过滤后2-8︒C保存。
3.微量加样器和加样头。
4.AnnexinVBindingBuffer缓冲液(Cat.No.66121E):
浓度为10⨯,使用时,用稀释为1⨯浓度的应用液。
5.AnnexinV试剂与核酸染料:
AnnexinV
核酸染料
AnnexinV-Biotin(Cat.No.65872X)
Streptavidin-FITC(Cat.No.13024D)
PI(Cat.No.66211E)或
7-AAD(Cat.No.34321X)
AnnexinV-FITC(Cat.No.65874X)
PI(Cat.No.66211E)
AnnexinV-PE(Cat.No.65875X)
7-AAD(Cat.No.34321X)
6.FACS流式细胞仪:
上样检测。
7.CELLQuest软件:
获取和分析试验数据。
8.AnnexinV检测对照管:
AnnexinV
A-阴性对照
B-补偿1
C-补偿2
Biotin
SAv-FITC
AnnexinV-Biotin
和SAv-FITC
PI和
SAv-FITC
PE
未染色细胞
AnnexinV-PE
7-AAD
FITC
未染色细胞
AnnexinV-FITC
PI
操作步骤
1.取Falcon试管,按标本顺序编好阴性对照管和标本管号。
2.使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次,再用1⨯BindingBuffer缓冲液制成1⨯106
细胞/ml的悬液。
3.Falcon试管中加入100µl细胞悬液。
4.按以下体积加入AnnexinV与核酸染料:
管号
名称
荧光标记AnnexinV
核酸染料:
1
阴性对照
-
-
2
单阳1
AV-FITC
-
3
单阳2
-
PI
4
样本
AV-FITC
PI
5.轻轻混匀,室温(20︒C~25︒C)避光处放置15分钟。
6.*使用AnnexinV-Biotin试剂进行检测时:
1⨯BindingBuffer缓冲液洗细胞一次,去上清。
1⨯BindingBuffer缓冲液100µl溶解SAv-FITC试剂0.5µg,加入到细胞管中。
轻轻混匀。
加入5µlPI,室温(20-25︒C)避光处放置15分钟。
7.各试验管中分别加入1⨯BindingBuffer缓冲液400µl。
8.1小时内上流式细胞仪测定结果。
结果分析:
以下4个样本分别是阴性对照、AnnexinV单阳管、PI单阳管和试验管。
100
101
102
FL1-Height
103
104
100101102103104
Annexin
100
101
102
FL1-Height
103
104
100101102103104
Annexin
AnnexinVBlocking
待测细胞与未标记的重组AnnexinV预孵育,然后进行实验,是AnnexinV细胞凋亡检测的质量控制。
原理是预先阻断AnnexinV-FITC的结合位点,这样可以证明AnnexinV-FITC凋亡分析的特异性。
1.使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次,再用1⨯BindingBuffer缓冲液制成1⨯106
细胞/ml的悬液。
2.在5ml的培养管中加入100µl细胞悬液(约1⨯105个细胞)。
3.加入5-15µg纯化的重组AnnexinV。
注意,不同的细胞系,以及凋亡的不同阶段,其AnnexinV位点饱和所需要的纯化的重组AnnexinV含量不同。
某些情况下,为达到最好效果,可以减少细胞数量,0.5⨯105个细胞加5-15µg纯化的重组AnnexinV。
4.轻轻混匀,室温反应15分钟。
5.加入5µl的AnnexinV-FITC或/和PI,轻轻混匀,室温避光处放置15分钟。
6.各试验管中分别加入1⨯BindingBuffer缓冲液400µl。
7.1小时内上流式细胞仪测定结果。
8.结果分析:
下图A、B为Anti-Fas抗体诱导3小时后的JurkatT细胞,图C、D为未处理的细胞;图A、C为AnnexinV-FITC染色的凋亡检测结果,图B、D为AnnexinVBlocking后的检测结果。
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规格
货号
AnnexinV-FITCApoptosisDetectionKitI:
PartA:
AnnexinV-FITC(100tests)PI(2ml)
1⨯BindingBuffer缓冲液(50ml)
100tests
6693KK
AnnexinV-FITCApoptosisDetectionKitII(AnnexinVBlocking):
PartA:
AnnexinV-FITC(100tests)PI(2ml)
1⨯BindingBuffer缓冲液(50ml)
PartB:
PurifiedRecombinantAnnexinV(100µg)
100tests
6710KK
凋亡细胞的DNA断裂片段分析
实验原理
在细胞发生凋亡后,最早出现胞膜外翻等现象,之后发生的程序性改变之一,就是细胞核酸内切酶激活,出现DNA断裂片段。
核酸酶将染色质的高级结构断裂为50-300kb的片段,最终断裂为200bp大小的DNA碎片。
DNA碎片检测的方法是外源性TdT酶催化反应,常指“end-labeling”或“TUNEL”(terminaldeoxynucleotidyltransferasedUTPnickendlabeling)。
现在可以使用APO-DIRECTKit,用流式细胞术来检测凋亡细胞由于DNA断裂,造成DNA链3’-OH增多的情况。
在APO-DIRECT分析中,TdT酶催化DNA单链和双链3’-OH末端非模板依赖性的dUTPFITC掺入反应。
由于采用了直接荧光标记的FITC-dUTP,所以一步反应后,就可以在流式细胞仪上检测DNA碎片。
APO-DIRECTKit(Cat.No.6536KK)试剂盒:
PartA(4︒C保存)
PI/RNaseASolutionReactionBufferRinsingBufferWashBuffer
PartB(-20︒C保存)
FITC-dUTP
TdTEnzyme
NegativeControlCells:
已固定细胞PositiveControlCells:
已固定细胞
实验用品
1.一次性12⨯75mmFalcon试管
2.蒸馏水
3.PBS缓冲液:
含0.1%NaN3,过滤后2-8︒C保存
4.固定液:
含1%多聚甲醛的PBS缓冲液
5.70%乙醇
6.冰浴箱
7.微量加样器和加样头
8.APO-DIRECTKit试剂盒
9.流式上机检测
操作步骤
1.细胞固定:
(1)用PBS洗细胞后,将细胞重悬于1%多聚甲醛中,浓度为1-2⨯106/ml,冰浴30-60分钟。
(2)300⨯g离心5分钟,弃上清。
(3)用5mlPBS洗细胞两次,重悬于70%乙醇中,浓度为1-2⨯106/ml,冰浴30-60分钟。
(70%乙醇细胞悬液在-20︒C放置12-18小时后进行细胞凋亡检测,得到的效果最好。
细胞可以在-20︒C保存几个月。
)
2.配制染色液,现用现配。
DNA标记液
1个测试
6个测试
12个测试
ReactionBuffer
10.00μl
60.00μl
120.00μl
TdTEnzyme
0.75μl
4.50μl
9.00μl
FITC-dUTP
8.00μl
48.00μl
96.00μl
蒸馏水
32.00μl
192.00μl
384.00μl
总体积
50.75μl
305.50μl
609.00μl
3.细胞染色:
(1)取离心管和Falcon试管,按标本顺序编号。
(2)取1⨯106细胞悬液加入离心管中,300⨯g离心5分钟,弃去乙醇,留下沉积细胞。
质控细胞(NegativeControlCells、PositiveControlCells):
混匀后取1ml
(细胞数约1⨯106/ml)加入离心管中,300⨯g离心5分钟,弃去乙醇,留下沉积细胞。
(3)每管各加入1.0mlWashBuffer,洗细胞两遍,弃上清。
(4)加入染色液50μl,混匀。
(5)37︒C温育60分钟(或者室温过夜),每15分钟摇匀一次。
(非质控细胞
37︒C温育时间需根据不同情况有所凋整。
)
(6)各管加入1.0mlRinseBuffer,300⨯g离心5分钟,弃上清。
重复两遍,弃去上清。
(7)加入0.5mlPI/RNaseASolution,混匀。
若细胞浓度低,可将用量调整到0.3ml。
(8)室温避光处反应30分钟。
(9)3小时内上流式细胞仪测定结果。
4.结果分析:
PI测定细胞DNA含量,FITC-BrdU测定调亡。
做DNA-W/DNA-A点图和DNA-A/FITC-BrdU点图,进行数据获取。
取单个细胞门(DNA-W/DNA-A设门),分析BrdU直方图,获得细胞凋亡信息。
同时,可分析细胞周期(DNA-A)与细胞凋亡(BrdU)的关系。
5.阴性质控细胞NegativeControlCells和阳性质控细胞PositiveControlCells:
实验原理
BrdUFlowKits检测细胞增殖
BrdU中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷,为胸腺嘧啶的衍生物,可代替胸腺嘧啶在DNA合成期(S期),活体注射或细胞培养加入,而后利用抗Brdu单克隆抗体,荧光染色,显示增殖细胞。
同时结合其它细胞标记物,可判断增殖细胞的种类,增殖速度,对研究细胞动力学有重要意义。
BrdUFlowKits是用BrdU染色和流式分析结合高效的试剂盒,包括在BrdU