流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程.docx

1、流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程流式检测细胞凋亡Annexin V 检测细胞凋亡实验原理Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与 DNA 碎片检测比较， 使用 Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以 Annexin V 常与鉴

2、定细胞死活的核酸染料(如 PI 或 7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-) 与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。实验用品1.一次性1275mm Falcon试管。2.PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8C保存。3.微量加样器和加样头。4.Annexin V Binding Buffer缓冲液（Cat. No. 66121E）：浓度为10，使用时，用稀释为1浓度的应用液。5.Annexin V试剂与核酸染料：Annexin V核酸染料Annexin V-Biotin（Cat. No. 65872X）Streptavidin-FITC（Cat

3、. No. 13024D）PI（Cat. No. 66211E）或7-AAD（Cat. No. 34321X）Annexin V-FITC（Cat. No. 65874X）PI（Cat. No. 66211E）Annexin V-PE（Cat. No. 65875X）7-AAD（Cat. No. 34321X）6.FACS流式细胞仪：上样检测。7.CELLQuest软件：获取和分析试验数据。8.Annexin V检测对照管：Annexin VA-阴性对照B-补偿 1C-补偿 2BiotinSAv-FITCAnnexin V-Biotin和 SAv-FITCPI 和SAv-FITCPE未染色细胞

4、Annexin V-PE7-AADFITC未染色细胞Annexin V-FITCPI操作步骤1.取 Falcon 试管，按标本顺序编好阴性对照管和标本管号。2.使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1 Binding Buffer缓冲液制成1106细胞/ml的悬液。3.Falcon试管中加入100 l细胞悬液。4.按以下体积加入Annexin V与核酸染料：管号名称荧光标记 Annexin V核酸染料：1阴性对照-2单阳 1AV-FITC-3单阳 2-PI4样本AV-FITCPI5.轻轻混匀，室温（20C 25C）避光处放置15分钟。6.*使用Annexin V-Biotin试剂进行检测时： 1

5、Binding Buffer缓冲液洗细胞一次，去上清。 1Binding Buffer缓冲液100l溶解SAv-FITC试剂0.5g，加入到细胞管中。 轻轻混匀。 加入5l PI，室温（20-25C）避光处放置15分钟。7.各试验管中分别加入1Binding Buffer缓冲液400l。8.1小时内上流式细胞仪测定结果。结果分析：以下 4 个样本分别是阴性对照、Annexin V 单阳管、PI 单阳管和试验管。100101102FL1-Height103104100 101 102 103 104Annexin100101102FL1-Height103104100 101 102 103 1

6、04AnnexinAnnexin V Blocking待测细胞与未标记的重组 Annexin V 预孵育，然后进行实验，是 Annexin V 细胞凋亡检测的质量控制。原理是预先阻断 Annexin V-FITC 的结合位点，这样可以证明 Annexin V-FITC 凋亡分析的特异性。1.使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1Binding Buffer缓冲液制成1106细胞/ml的悬液。2.在5ml的培养管中加入100l细胞悬液（约1105个细胞）。3.加入5-15g纯化的重组Annexin V。注意，不同的细胞系，以及凋亡的不同阶段，其Annexin V位点饱和所需要的纯化的重组Anne

7、xin V含量不同。某些情况下，为达到最好效果，可以减少细胞数量，0.5105个细胞加5-15g纯化的重组Annexin V。4.轻轻混匀，室温反应15分钟。5.加入5l的Annexin V-FITC或/和PI，轻轻混匀，室温避光处放置15分钟。6.各试验管中分别加入1Binding Buffer缓冲液400l。7.1小时内上流式细胞仪测定结果。8.结果分析：下图 A、B 为 Anti-Fas 抗体诱导 3 小时后的 Jurkat T 细胞, 图 C、D 为未处理的细胞；图 A、C 为 Annexin V-FITC 染色的凋亡检测结果，图 B、D 为 Annexin V Blocking 后的

8、检测结果。PharMingen 推荐 Annexin V 细胞凋亡检测试剂盒规格货号Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I:Part A：Annexin V-FITC(100 tests) PI (2ml)1Binding Buffer 缓冲液(50ml)100tests6693KKAnnexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II (Annexin V Blocking):Part A：Annexin V-FITC(100 tests) PI (2ml)1Binding Buffer 缓冲液(50ml)Part B：P

9、urified Recombinant Annexin V(100g)100tests6710KK凋亡细胞的 DNA 断裂片段分析实验原理在细胞发生凋亡后，最早出现胞膜外翻等现象，之后发生的程序性改变之一， 就是细胞核酸内切酶激活，出现 DNA 断裂片段。核酸酶将染色质的高级结构断裂为 50-300kb 的片段，最终断裂为 200bp 大小的 DNA 碎片。DNA 碎片检测的方法是外源性 TdT 酶催化反应，常指“end-labeling”或“TUNEL” (terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end labeling)。现在可以使用

10、APO-DIRECT Kit，用流式细胞术来检测凋亡细胞由于 DNA 断裂，造成 DNA 链 3-OH 增多的情况。在 APO- DIRECT 分析中，TdT 酶催化 DNA 单链和双链 3-OH 末端非模板依赖性的 dUTP FITC 掺入反应。由于采用了直接荧光标记的 FITC-dUTP，所以一步反应后，就可以在流式细胞仪上检测 DNA 碎片。APO-DIRECT Kit（Cat. No. 6536KK）试剂盒：Part A（4C 保存）PI/RNase A Solution Reaction Buffer Rinsing Buffer Wash BufferPart B（-20C 保存）

11、FITC-dUTPTdT EnzymeNegative Control Cells：已固定细胞Positive Control Cells：已固定细胞实验用品1.一次性 1275mm Falcon 试管2.蒸馏水3.PBS 缓冲液：含 0.1%NaN3，过滤后 2-8C 保存4.固定液：含 1%多聚甲醛的 PBS 缓冲液5. 70%乙醇6.冰浴箱7.微量加样器和加样头8.APO-DIRECT Kit 试剂盒9.流式上机检测操作步骤1.细胞固定：（1）用 PBS 洗细胞后，将细胞重悬于 1%多聚甲醛中，浓度为 1-2106/ml，冰浴30-60 分钟。（2）300g 离心 5 分钟，弃上清。（3

12、）用 5ml PBS 洗细胞两次，重悬于 70%乙醇中，浓度为 1-2106/ml，冰浴 30-60 分钟。（70%乙醇细胞悬液在-20C 放置 12-18 小时后进行细胞凋亡检测， 得到的效果最好。细胞可以在-20C 保存几个月。）2.配制染色液，现用现配。DNA 标记液1 个测试6 个测试12 个测试Reaction Buffer10.00l60.00l120.00lTdT Enzyme0.75l4.50l9.00lFITC-dUTP8.00l48.00l96.00l蒸馏水32.00l192.00l384.00l总体积50.75l305.50l609.00l3.细胞染色：（1）取离心管和

13、Falcon 试管，按标本顺序编号。（2）取 1106 细胞悬液加入离心管中，300g 离心 5 分钟，弃去乙醇，留下沉积细胞。质控细胞（Negative Control Cells、Positive Control Cells）：混匀后取 1ml（细胞数约 1106/ml）加入离心管中，300g 离心 5 分钟，弃去乙醇，留下沉积细胞。（3）每管各加入 1.0ml Wash Buffer，洗细胞两遍，弃上清。（4）加入染色液 50l，混匀。（5）37C 温育 60 分钟（或者室温过夜），每 15 分钟摇匀一次。（非质控细胞37C 温育时间需根据不同情况有所凋整。）（6）各管加入 1.0ml

14、Rinse Buffer，300g 离心 5 分钟，弃上清。重复两遍，弃去上清。（7）加入 0.5ml PI/RNase A Solution，混匀。若细胞浓度低，可将用量调整到0.3ml。（8）室温避光处反应 30 分钟。（9）3 小时内上流式细胞仪测定结果。4.结果分析：PI 测定细胞 DNA 含量，FITC-BrdU 测定调亡。做 DNA-W/DNA-A 点图和 DNA-A/FITC-BrdU 点图，进行数据获取。取单个细胞门（DNA-W/DNA-A 设门），分析 BrdU 直方图，获得细胞凋亡信息。同时，可分析细胞周期（DNA-A）与细胞凋亡（BrdU）的关系。5.阴性质控细胞 Negative Control Cells 和阳性质控细胞 Positive Control Cells：实验原理BrdU Flow Kits 检测细胞增殖BrdU中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷，为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu 单克隆抗体，荧光染色，显示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义。BrdU Flow Kits是用 BrdU染色和流式分析结合高效的试剂盒，包括在BrdU