戊己丸化学指纹图谱与血清指纹图谱及抗胃溃疡药效作用谱效关系相关性分论文.docx
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戊己丸化学指纹图谱与血清指纹图谱及抗胃溃疡药效作用谱效关系相关性分论文
戊己丸（化学指纹图谱与）血清指纹图谱及抗胃溃疡药效作用：
谱效关系相关性分
采用UPLC/MS分析11批不同药材来源戊己丸提取液体内血清指纹图谱特征成分，通过UPLC/MS-ESI正离子扫描获得了戊己丸指纹图谱的一些结构信息，对指纹图谱中的部分色谱峰进行了结构归属的初步判断，并采用对照品进行指认，其它峰通过一级质谱和二级质谱分析，结合参考文献与化合物质谱裂解规律，提出了快速检测和识别戊己丸体内血清质谱分析方法，并进行11批戊己丸抗胃溃疡药效试验，采用聚类分析、主成分分析、灰色关联度分析等统计学方法，建立戊己丸抗胃溃疡药效作用的体内血清谱效关系，根据谱效关系研究结果，以整体药效物质为研究对象，从整体上分析戊己丸抗胃溃疡的药效物质基础，及各组分对整个复方药效作用的贡献程度大小及作用，赋予指纹图谱药效信息，确定有效成分权重系数大小，为实现戊己丸有效药物成分精准治疗提供依据。
包括三个主要步骤：
第一，建立11批戊己丸体内血清指纹图谱，结合保留时间、质量分数、特征片段及相关文献研究，鉴定血清指纹化合物的结构或其初步特征。
第二，采用大鼠胃溃疡模型，对11批戊己丸进行药效学试验，以血清中药效指标胃泌素（GAS）、超氧化物歧化酶（SOD）、前列腺素E2含量测定体现戊己丸抗大鼠胃溃疡药效作用。
第三，分析戊己丸体内化学成分（指纹峰峰面积）与药效指标之间的关联性，对指纹图谱信息（指纹峰峰面积）与抗胃溃疡药效作用进行拟合，构建戊己丸指纹图谱信息与药效作用之间的数学模型。
关键词：
戊己丸，血清指纹图谱，胃溃疡，药效学，灰色关联度，谱效关系
1∣介绍
戊己丸由黄连、吴茱萸、白芍3味中药组成，三药配伍具有辛开苦降、泻肝和胃、降逆止呕、止泻之功效，《中国药典》从1977年至2015年版都收载有戊己丸成方制剂，剂型均为丸剂。
现代药理研究表明，戊己丸临床上用于消化系统溃疡的治疗，均取得满意疗效，其中含有生物碱、黄酮类、内酯类、苷类、挥发油类等多种成分。
鉴于戊己丸中药材成分复杂，药效物质难以确定，目前还没有能够快速、全面、准确地处理戊己丸的血清成分概况的有效报告。
所以，我们团队对戊己丸进行了大量的研究，提供了坚实的物质基础。
传统中药发挥药效作用的物质基础解密一直是中医药现代化发展的瓶颈。
通常，植物的成分可以分为几个类似的成分组。
这些化合物属于同一种类化学物，具有相似的主体结构，但它们的取代基的类型或位置是不同的。
他们可能会产生一系列类似的分子离子，通过UPLC/MS显示质量碎片路径，从而识别中草药中的化学成分。
建立体内血清指纹图谱，可对其血清固有成分、原型成分和代谢产物进行分析鉴定。
胃溃疡是指胃黏膜在某种情况下被胃酸/胃蛋白酶自身消化而造成的溃疡。
戊己丸来源于宋代《太平惠民和剂局方》，从古一直沿用至今，临床疗效确切，常用于胃溃疡疾病的治疗，获得较好疗效。
胃溃疡的发生与治疗与相关免疫因子的含量变化密切相关，本研究中，对血清中药效指标胃泌素（GAS）、超氧化物歧化酶（SOD）、前列腺素E2的含量进行测定，为戊己丸抗胃溃疡药效作用提供数据支撑。
谱效关系是指纹图谱与药效作用的桥梁，通过指纹图谱信息与药效作用的相互关系研究，可以揭示中药所含的化学成分与药效之间的相互关系和规律，是将指纹图谱、化学成分及其组合与药效学研究紧密相结合的一种研究思路，并且可赋予中药指纹图谱更多药效信息。
本研究通过谱效关系研究获得了药效活性物质，建立了复方戊己丸谱效关系评价的方法，为该类中药制剂后期创新研究提供了参考依据。
为中药谱效关系分析提供了一种较为有效的方法，以期为其他中药复方的血清谱效关系分析提供参考。
2∣材料和方法
2.1∣材料
2.1.1∣中药材原料药
黄连、吴茱萸、白芍药材购买于国内不同药材市场或者药店，见表1，不同产地及品种黄连为毛茛科植物黄连CoptischinensisFranch.、三角叶黄连CoptisdeltoideaC.K.ChengetHsiao或云连CoptisteetaWall.的干燥根茎；吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Euodiarutaecarpa（Juss.）Benth.、石虎Euodiarutaecarpa（Juss.）Benth.var.officinalis（Dode）Huang或疏毛吴茱萸Euodiarutaecarpa（Juss.）Benth.var.bodinieri（Dode）Huang的干燥近成熟果实；白芍为毛莨科植物芍药PaeonialactifloraPall.的干燥根，经贵阳中医学院周汉华教授鉴定为正品。
戊己丸按照《中国药典》2015年版方法实验室制备。
表111批不同来源的药材
Table1Elevenbatchesmedicinalherbsfromdifferenthabitats
复方批次
黄连
吴茱萸
白芍
产地
来源
批号
产地
来源
批号
产地
来源
批号
160827（S1）
四川
贵州同济堂药店
150701
贵州印江
凉山新鑫中药饮片
140601
安徽
凉山新鑫中药饮片
161101
160827（S2）
四川
贵州同济堂药店
151001
贵州思南
北京同仁堂药店
140601
安徽
亳州京皖中药饮片
151101
160829（S3）
四川
贵州同济堂药店
160101
贵州玉屏
贵阳一品药业
040301
浙江
北京同仁堂药店
141101
160831（S4）
四川
北京同仁堂药店
151101
贵州德江
贵州同济堂药店
140807
浙江
贵州同济堂药店
140811
160831（S5）
四川
贵州同济堂药店
160101
贵州江口
北京同仁堂药店
140502
浙江
贵阳一品药业
140301
160831（S6）
四川
贵阳一品药业
150401
贵州大方
北京同仁堂药店
140602
浙江
贵阳一品药业
141001
160902（S7）
四川
贵州同济堂
151201
贵州威宁
贵州同济堂药店
141001
安徽
贵州同济堂药店
140501
160902（S8）
重庆
贵阳怀仁大药房
141102
贵州石阡
贵阳一品药业
140602
安徽
贵阳芝林大药房
140312
160903（S9）
重庆
贵阳怀仁大药房
150601
贵州沿河
贵阳芝林大药房
140701
安徽
贵阳一品药业
140602
160904（S10）
重庆
贵阳芝林大药房
150501
贵州天柱
北京同仁堂药店
160301
安徽
贵阳济仁堂药店
150302
160904（S11）
湖北
北京同仁堂
160601
贵州思南
凉山新鑫中药饮片
140601
安徽
安徽亳州药材市场
140609
2.1.2∣试剂
对照品盐酸小檗碱（批号110713-201212，质量分数：
86.7%，中国食品药品检定研究院），盐酸巴马汀（批号110732-201309，质量分数：
87.4%，中国食品药品检定研究院），盐酸药根碱（批号110733-201108，质量分数：
98.0%，中国食品药品检定研究院），黄连碱（批号GZDD-0426，质量分数：
98.0%，贵州迪达科技有限责任公司），表小檗碱（批号GZDD-0833，质量分数：
98.0%，贵州迪达科技有限责任公司）；吴茱萸碱（批号110802-201409，质量分数：
99.4%，中国食品药品检定研究院），吴茱萸次碱（批号110801-201207，质量分数：
99.9%，中国食品药品检定研究院），吴茱萸内酯（批号110800-20120，质量分数：
99.9%，中国食品药品检定研究院）；芍药苷（批号110736-201640，质量分数:
95.2%，中国食品药品检定研究院），芍药内酯苷（批号GZDD-0690，质量分数：
98.0%，贵州迪达科技有限责任公司）。
乙腈为色谱纯（德国Merck公司），其他为分析纯，PEP试剂盒（上海哈灵生物科技有限公司，货号：
HL20040规格：
96T），屈臣氏蒸馏水等。
2.1.3∣实验动物
SPF级Wistar大鼠，12周龄，体重质量200±20g，雌雄各半。
购自贵州医科大学实验动物中心，动物质量合格证编号SCXK（黔）2012-0001。
2.2∣大鼠分组及给药
大鼠适应性饲养1周后，将其随机分为14组，分别为空白对照组、模型组、戊己丸给药组（共11组）、西咪替丁阳性组。
每组8只，雌雄各半。
称其体重质量，按5mL/kg的剂量（相当于成人临床等效剂量6倍），分别对应给予给药组各批次提取液，连续给药7d，每日1次，第7天给药后将大鼠禁食、不禁水24h。
第8天采用幽门结扎法造模：
将大鼠用乙醚麻醉后，固定在鼠板上，自胸骨剑突下沿腹中线切开腹壁，切口2～3cm。
在左侧肋缘部位，用指轻轻往上推，使胃暴露于切口。
在胃幽门下穿一线（勿伤及血管）将幽门结扎（不要将邻近的其他血管结扎），同时经十二指肠注射器注入被试药物，对照组给予等容量生理盐水。
2.3∣样品的制备
2.3.1∣大鼠灌胃液样品的制备
乙醇总提取物的制备方法：
按处方称取相应药材，分别第1次加入8倍量70%乙醇，回流提取1h，第2次加入6倍量50%乙醇，回流提取1h，滤过，合并滤液，60℃水浴挥干乙醇制成干浸膏，临用加适量水超声制成混悬液，使各配伍组中各组成药材生药质量浓度与全方相应药材生药质量浓度相同，剩余混悬液4℃冰箱保存。
2.3.2∣进样溶液样品的制备
乙腈法：
大鼠股主动脉采血，血液置5ml离心管中8000r/min离心15min，分离血清，每组血清混合，用移液器精密吸取含药血清样品1mL，加3倍量乙腈，采用涡旋混合器涡旋混匀5min，转速15000rpm离心15min，取上清液过0.22μm微孔滤膜为含药血清供试品。
按照制备含药血清的方法制备空白血清供试品。
准确称量了10种标准物质于10毫升甲醇中溶解，配制浓度从4.45–79.56微克/毫升的对照品溶液，温度维持在4°C使用。
2.4∣色谱法和MS条件
血清样品分析都是在ACQUITYUPLC（美国Waters公司），质谱检测器（Waters-XevoTQ）；MassLynxTM质谱工作站软件（Waters公司）进行分析，色谱法是色谱柱为AcquityUPLCBEHC18色谱柱（100mm×2.1mm，1.7μm）；柱温40℃，样品温度10℃，体积流量0.4mL/min，进样量2μL；以水（A，含0.05%甲酸）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱程序：
0～5min，8%～15%B；5～10min，15%～18%B；10～12min，18%～20%B；12～14min，20%～35%B；14～24min，35%～40%B；24～30min，40%～50%B；30～43min，50%～55%B；43～55min，55%～59%B。
优化后的MS参数设置如下:
离子源为ESI源，正离子扫描模式；毛细管电压3.0kV；取样锥孔电压30V；离子源温度150℃；脱溶剂气温度500℃；脱溶剂气体积流量600L/hr；锥孔气体积流量50L/hr；扫描范围：
m/z100～1000，采用MS-Scan模式采集总离子流图。
2.5∣数据处理
戊己丸含药血清的UPLC-MS/MS图谱数据由国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”进行处理，并初步鉴定检测戊己丸血清指纹图谱中化学物质成分；戊己丸抗胃溃疡药效作用主要使用酶标仪（芬兰LabsystemsMultiskanMS雷勃公司）进行测定，数据及谱效关系分析采用软件SPSS19.0进行处理，得到药效数据及谱效关系模型。
3∣结果与讨论
3.1∣戊己丸含药血清指纹图谱研究
3.1.1∣方法学考察
（1）精密度试验
精密吸取2μl同一份含药血清供试品溶液，连续进样6次，测得各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD分别为1.65%和3.48%，表明进样和仪器精密度良好，符合指纹图谱的技术要求（见附录1，附图1）。
（2）稳定性试验
精密吸取同一份含药血清供试品溶液，分别在0、2、4、6、12、24h进样2μl，测得供试品溶液各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD分别为1.34%和3.26%，表明样品溶液在24h内稳定性良好，符合指纹图谱的技术要求（见附录2，附图2）。
（3）重复性试验
精密吸取含药血清供试品溶液，分别进样2μL，测得血清供试品溶液各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD分别为1.09%和3.85%，表明方法重复性良好，符合指纹图谱的技术要求（见附录3，附图3）。
3.1.2∣戊己丸含药血清指纹图谱的建立
按上述方法测定11批不同产地的戊己丸UPLC-MS/MS含药血清指纹图谱，所得混合对照品图谱如图1、体外供试品溶液如图2、空白血清溶液如图3、含药血清溶液如图4所示；建立的11批不同产地的戊己丸UPLC-MS/MS含药血清指纹图谱叠加图如图5所示。
FIGURE1混合对照图谱
FIGURE2空白血清图谱
FIGURE3戊己丸体外样品图谱
FIGURE4戊己丸含药血清图谱
FIGURE511批戊己丸UPLC-MS/MS含药血清指纹图谱叠加图
根据保留时间，确定了34个共有峰，其中11号峰保留时间稳定，峰面积相对适中，选择11号峰为参照峰。
把参照峰保留时间和峰面积积分值定为1，得到的各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，计算结果见表2和表3。
由表2和表3可知，各共有峰的相对保留时间的RSD均小于1%，而相对峰面积RSD则较大，最大的为5.8%，说明在实验过程中实验动物之间存在着个体差异的影响。
表211批戊己丸血清指纹图谱共有峰相对保留时间
峰号
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
S10
S11
平均值
RSD
1
0.223
0.218
0.225
0.221
0.224
0.223
0.225
0.224
0.226
0.225
0.224
0.223
0.988
2
0.382
0.375
0.379
0.370
0.377
0.375
0.379
0.370
0.379
0.375
0.377
0.376
0.915
3
0.573
0.582
0.583
0.584
0.581
0.581
0.586
0.584
0.589
0.589
0.594
0.584
0.905
4
0.589
0.583
0.590
0.583
0.585
0.582
0.584
0.580
0.582
0.579
0.581
0.583
0.559
5
0.600
0.595
0.599
0.607
0.600
0.595
0.599
0.601
0.596
0.605
0.599
0.600
0.586
6
0.695
0.694
0.693
0.694
0.694
0.696
0.694
0.695
0.697
0.698
0.693
0.695
0.213
7
0.749
0.739
0.761
0.742
0.750
0.749
0.753
0.748
0.753
0.751
0.755
0.750
0.752
8
0.809
0.808
0.815
0.801
0.809
0.808
0.815
0.801
0.809
0.808
0.815
0.809
0.594
9
0.846
0.843
0.840
0.846
0.836
0.841
0.843
0.840
0.845
0.843
0.847
0.843
0.374
10
0.950
0.946
0.955
0.946
0.950
0.946
0.955
0.946
0.950
0.949
0.952
0.949
0.359
11（S）
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
0.000
12
1.132
1.124
1.134
1.121
1.132
1.124
1.134
1.121
1.132
1.124
1.134
1.128
0.460
13
1.259
1.252
1.257
1.253
1.258
1.254
1.261
1.252
1.258
1.255
1.261
1.256
0.248
14
1.339
1.332
1.335
1.335
1.339
1.335
1.342
1.314
1.341
1.338
1.345
1.336
0.586
15
1.403
1.402
1.396
1.397
1.399
1.394
1.400
1.389
1.395
1.390
1.406
1.397
0.355
16
2.799
2.781
2.802
2.781
2.794
2.785
2.798
2.779
2.792
2.783
2.797
2.790
0.291
17
2.843
2.836
2.853
2.838
2.854
2.848
2.865
2.849
2.866
2.860
2.877
2.854
0.426
18
2.890
2.875
2.892
2.870
2.890
2.879
2.897
2.870
2.890
2.875
2.892
2.884
0.329
19
3.161
3.153
3.197
3.152
3.161
3.153
3.177
3.152
3.161
3.153
3.177
3.163
0.439
20
3.204
3.191
3.206
3.191
3.204
3.195
3.211
3.190
3.206
3.197
3.213
3.201
0.251
21
3.488
3.475
3.494
3.472
3.489
3.480
3.597
3.494
3.492
3.482
3.500
3.497
0.940
22
3.743
3.731
3.754
3.726
3.746
3.735
3.755
3.729
3.749
3.738
3.757
3.742
0.277
23
3.946
3.930
3.944
3.920
3.946
3.930
3.944
3.890
3.946
3.930
3.944
3.934
0.409
24
4.000
3.986
4.015
3.971
4.000
3.986
4.015
3.971
4.000
3.986
4.015
3.995
0.391
25
4.068
4.046
4.084
4.038
4.062
4.049
4.068
4.039
4.057
4.044
4.073
4.057
0.355
26
4.142
4.120
4.145
4.113
4.142
4.120
4.145
4.103
4.132
4.123
4.145
4.130
0.348
27
4.228
4.215
4.240
4.205
4.228
4.215
4.236
4.142
4.228
4.215
4.236
4.217
0.615
28
4.340
4.322
4.338
4.309
4.340
4.322
4.240
4.311
4.340
4.322
4.341
4.320
0.643
29
4.460
4.440
4.468
4.424
4.456
4.442
4.463
4.432
4.453
4.439
4.461
4.449
0.304
30
4.726
4.706
4.725
4.697
4.716
4.700
4.721
4.577
4.708
4.692
4.724
4.699
0.857
31
4.852
4.836
4.864
4.838
4.849
4.841
4.865
4.832
4.857
4.843
4.868
4.849
0.246
32
4.925
4.904
4.932
4.911
4.925
4.904
4.932
4.911
4.925
4.802
4.922
4.908
0.716
33
5.157
5.119
5.157
5.129
5.159
5.145
5.180
5.138
5.164
5.151
5.177
5.152
0.351
34
5.312
5.297
5.313
5.289
5.310
5.294
5.320
5.283
5.309
5.293
5.319
5.304
0.228
表311批戊己丸含药血清指纹图谱共有峰相对峰面积
峰号
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
S10
S11
平均值
RSD
1
0.625
0.626
0.643
0.612
0.611
0.607
0.602
0.598
0.594
0.590
0.629
0.612
2.709
2
0.026
0.026
0.025
0.026
0.025
0.
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