实验技术.docx

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实验技术

分子生物学实验指导

实验一、植物基因组DNA的分离

一．实验目的

掌握从植物组织中分离纯化基因组DNA的方法。

二．实验原理

通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类（尤其是氧化酶类）对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂（如巯基乙醇）以降低这些酶类的活性。

在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。

十二烷基肌酸钠（sarkosyl）．十六烷基三甲基溴化铵（hexadyltrimethylammomumbromide，简称为CTAB）．十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate，简称SDS）等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。

再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸（DNA．RNA）水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。

上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。

三．实验材料与试剂

材料：

凤仙花幼叶

试剂：

１．2%CTAB抽提缓冲溶液：

CTAB4gNaCl16.364g；

２．1MTris-HCl20ml　（PH8.0）：

0.5MEDTA8ml，先用70mlddH2O溶解,再定容至200ml灭菌,冷却后0.2-1%2-巯基乙醇（400ul）；

３．氯仿-异戊醇（24:

1）：

先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。

四．实验步骤

１．2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。

２．取少量叶片（约1g）置于研钵中，用液氮磨至粉状；

３．加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；

４．将磨碎液分倒入1.5ml的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二；

５．置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10min轻轻摇动，40min后取出；

６．冷却2min后，加入氯仿-异戊醇（24：

1）至满管，剧烈振荡2～3min，使两者混合均匀；

７．放入离心机中10000rpm离心10min，与此同时，将600µl的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中；

８．10000rpm离心1min后，移液器轻轻地吸取上清液，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；

９．10000rpm离心1min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上；

10．60sec后，直立离心管，加入720µl的75%乙醇及80µl5M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；

11．放置30min，使DNA块状物的不纯物溶解；

12．10000rpm离心1min后，倒掉液体，再加入800µl75%的乙醇洗涤DNA；

13．10000rpm离心30sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）；

14．加入50µl0.5×TE（含RNase）缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约15h，使RNA消解；

置于-20℃保存．备用。

五．实验注意事项

1．叶片磨得越细越好；

2．移液器的使用；

3．由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。

实验二质粒DNA的提取

一．实验目的

通过本实验掌握碱裂解法提取质粒。

二．实验原理

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。

在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合环状质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。

当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

质粒DNA尚在上清中。

三．仪器与试剂

 仪器

1． 恒温培养箱

2． 恒温摇床

3． 台式离心机

4． 高压灭菌锅

（二）  试剂

１．溶液I

50mmol/L葡萄糖

25mmol/LTris·HCl（pH8.0）

10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）

２．溶液II

0.4mol/LNaOH,2%SDS,用前等体积混合

３．溶液III

5mol/L乙酸钾60mL

冰乙酸11.5mL

水28.5mL

４．TE缓冲液

10mmol/LTris·HCl

1mmol/LEDTA（pH8.0）

70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回）

四．实验步骤

1．在5ml含相应抗生素Amp的LB液体培养基中接入单菌落，于37℃振荡培养过夜。

2．取1.5ml培养物倒入Eppendorf管中，10000r/min离心1min。

3．吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。

4．将细菌沉淀悬浮于100μL冰预冷的溶液I中，涡旋，使沉淀溶解。

5．加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧管皿，快速颠倒5次，混匀内容物，将Eppendo

管放在冰上。

6．加入150μL溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min。

7．10000r/min，离心5min，将上清夜转至另一Eppendorf管中。

8．向上清夜加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置5-10min。

10000r/min离心5min。

倒去上清夜，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。

9．用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清夜，真空抽干或空气中

干燥。

10．50μLTE缓冲液，使DNA完全溶解，-20℃保存。

实验三琼脂糖凝胶电泳检测DNA

一．实验目的

1．掌握制不同浓度的琼脂糖凝胶的方法。

2．学会用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法。

二．实验原理

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。

DNA分子的高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的静电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。

在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。

具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。

DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。

凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，如pUC19质粒，有3种构型：

超螺旋的共价闭合环状质粒DNA（covalentlyclosedcircularDNA,简称cccDNA），开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA1条链断裂（opencircularDNA,简称ocDNA），线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂（linearDNA, 简称LDNA）。

这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移速度不同。

因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。

三．仪器与试剂

（一）仪器

1．琼脂糖凝胶电泳系统

2．凝胶成像系统

3．微波炉

4．移液枪

（二）试剂

１．5×TAE（5倍体积的TAE贮存液）

配1000ml5×TAE：

Tris242g

冰乙酸57.1ml

0.5mol/lEDTA100ml（pH8.0）

２．凝胶加样缓冲液（6×）

溴酚蓝0.25%

蔗糖40%（w/v）

３．琼脂糖

４．溴化乙锭溶液（EB）0.5μg/ml

四．实验步骤

１．制备琼脂糖凝胶

按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。

可参照下表：

琼脂糖凝胶浓度/%线性DNA的有效分离范围/kb

0.3　　　　　　　　　　　　　　5～60

0.6　　　　　　　　　　　　　　1～20

0.7　　　　　　　　　　　　　　0.8～10

0.9　　　　　　　　　　　　　　0.5～7

1.2　　　　　　　　　　　　　　0.4～6

1.5　　　　　　　　　　　　　　0.2～4

2.0　　　　　　　　　　　　　　0.1～3

称取0.3g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30ml1×TAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为1%琼脂糖凝胶液，按100ml的凝胶加5μl的EB。

２．胶板的制备

取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙）。

将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。

将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。

待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放在电泳槽内。

加入电泳缓冲液至电泳槽中。

３．加样

用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品（可将上一次实验产物作电泳材料）加入加样孔中（记录点样顺序及点样量）。

４．电泳

接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。

DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。

当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。

实验四RAPD-PCR技术

一．实验目的

通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。

二．实验原理

运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记。

这种方法即为RAPD（RandomamplifiedpolymorphicDNA，随机扩增的多态性DNA）。

RAPD技术建立于PCR技术基础上，它是利用一系列不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链（通常为10聚体）为引物，对所研究基因组DNA进行PCR扩增。

琼脂糖电泳分离，经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片断的多态性，这些扩增产物DNA片断的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。

RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同，但对于任一特异的引物，它同基因组DNA序列有其特异的结合位点。

这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件，即引物在模板的两条链上有互补位置，且引物3’端相距在一定的长度范围之内，就可扩增出DNA片段。

因此如果基因组在这些区域发生DNA片段插入．缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化，而使PCR产物增加．缺少或发生分子量的改变。

通过对PCR产物检测即可检出基因组DNA的多态性。

分析时可用的引物数很大，虽然对每一个引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的，但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。

因此RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。

另外，RAPD片段克隆后可作为RFLP的分子标记进行作图分析。

三．仪器与试剂

（一）仪器

１．PCR热循环仪

２．PCR管

３．琼脂糖凝胶电泳系统

４．凝胶成像系统

（二）材料与试剂

1．随机引物（10mer）（5μmol/L）：

购买成品。

2．Tag酶

3．10×缓冲液

4．MgCl2：

25mmol/L

5．dNTP：

每种2.5mmol/L

四．实验步骤

1．PCR反应体系：

反应物体积/μL

10×buffer2.5

dNTP2.0

随机引物1.0（约5pmol）

MgCl22.0

Taq酶1个单位

Template1（约50ng）

加水至总体积25μL，混匀稍离心。

2．PCR热循环程序

①．94℃预变性2min

②．94℃变性1min

③．36℃退火1min

④．72℃延伸1min

⑤．重复步骤②～④30次；

⑥．72℃延伸10min

3．琼脂糖凝胶电泳

配制0.7%琼脂糖凝胶，取5μL扩增产物电泳。

稳压50-100V（电压低带型整齐，分辨率高）。

电泳结束后，紫外灯下观察结果。

实验五大肠杆菌感受态细胞的制备

一．实验目的

通过本实验，掌握用CaCl2制备新鲜的感受态。

二．实验原理

细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。

其原理是细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。

能接受外源DNA。

转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。

将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（如Ampr等）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上。

三．仪器．材料与试剂

（一）仪器

1．超净工作台

2．低温离心机

3．恒温摇床

（二）试剂

1．LB平板

2．LB液体培养基

配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入：

胰蛋白胨（bacto-typtone）　　10g

酵母提取液（bacto-yeastextract）5g

NaCl10g

摇动容器直至溶质完全溶解，用NaOH调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20min。

3．氨苄青霉素（Amp）

用无菌水配制成100mg/ml溶液，置-20℃冰箱保存。

４．2倍TSS致敏缓冲液（20ml）

PEG（3350－8000）4g（聚乙二醇，需灭菌）

1MCaCl22ml（需灭菌）

DMSO2ml（不能高压灭菌）

用LB液体培养基定容至20ml（不加Amp）。

四．实验步骤

1．挑取保存菌少许，划于LB平板，37℃过夜。

2．挑取一个单菌落接于200mLLB液体培养基的三角瓶中，18℃，150-250rpm振荡培养20h左右，使OD600＝0.3-0.4。

3．用冰预冷的2倍TSS致敏缓冲液于菌液（1：

1）中，冰上温和摇匀，分装至1.5ml预冷的离心管中，并立刻放入液氮中冷却，然后放到-70℃保存。

实验六重组质粒的连接．转化及筛选

一．实验目的

通过本实验学会重组DNA连接．转化以及筛选重组子的方法。

二．实验原理

因载体质粒pBS带有Ampr基因而外源片段上不带该基因，故转化受体菌后只有带有pBSDNA的转化子才能在含有Amp的LB平板上存活下来；而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活。

此为初步的抗性筛选。

外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。

重组的DNA分子是DNA连接酶的作用下，有Mg2+．ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。

DNA连接酶有两种：

T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。

两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。

但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。

T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：

首先，T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物；然后，酶-AMP复合物再结合到具有5′磷酸基和3′羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后，产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。

DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过（牛小肠碱性磷酸酶）CIP处理克服。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。

但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。

因此人们找到了一个折中温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。

重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。

利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。

现在使用的许多载体都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子及其α肽链的DNA序列，此结构称为lacZ′基因。

LacZ′基因编码的α肽链是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段（146个氨基酸）。

宿主和质粒编码的片段各自都不具有酶活性，但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的β半乳糖苷酶分子。

LacZ′基因编码的α肽链与失去了正常氨基端的β半乳糖苷酶突变体互补，这种现象称为α互补。

由α互补而形成的有功能活性的β半乳糖苷酶，可以用X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）显色出来，它能将无色的化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-靛蓝。

因此，任何携带着lacZ′基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种β半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，便会产生出有功能活性的β半乳糖苷酶，在IPTG（异丙基硫代β-D-半乳糖苷）诱导后，在含有X-gal的培养基平板上形成蓝色菌落。

而当有外源DNA片段插入到位于lacZ′中的多克隆位点后，就会破坏α肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内突变的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽，而导致不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。

三．仪器．材料与试剂

（一）  仪器

１．恒温摇床

２．恒温水浴锅

３．恒温培养箱

４．低温离心机

（二）试剂

1．连接反应缓冲液（10X）

2．T4DNA连接酶

3．X－gal储液（20mg/ml）

4．IPTG储液（200mg/ml）

5．EcoRI酶

6．DH5α

7．λDNA

8．pUC19质粒

四．实验步骤

（一）质粒重组

1．在灭菌的Eppendorf管中，加入pUC19质粒2μL（2μg/μL），2μL酶切缓冲液，1μLEcoRI酶，无菌双蒸水15μL，至反应混合物总体积为20μL。

离心混匀，37℃反应3h（酶及缓冲液应放在冰上）。

2．在另一无菌Eppendorf管中，加λDNA1.5μg，加1μL酶切反应液，1μLEcoRI酶，无菌双蒸水补到10μL，37℃反应3h。

3．反应完毕后，各取2μL酶解液做电泳分析。

4．分别将余下的酶解液加入1/10体积的3mol/LKAc（pH5.2）溶液，再加2倍体积的无水乙醇，-20℃冰箱，2h（沉淀DNA）。

12000r/min4℃离心15min，弃上清，加70%乙醇洗沉淀物，再离心，去上清，真空干燥后，加5μLTE溶液。

将酶切后的2个DNA片段混合于一管中，加T4DNA连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶1μL，16℃保温14h，并做转化实验。

（二）连接产物的转化

1．取100μl贮存于-70℃钙化菌，冰浴化开；

2．加入适量连接产物（一般不超过10μl），轻轻混匀，冰浴20min；

3．于42℃热休克90s，迅速转移至冰浴中，继续冰浴2-3min；

4．加入LB液体培养基200μl，于37℃缓摇孵育45min；

5．将培养物适量涂于1.5%琼脂LB平板（根据质粒性质添加抗生素或/和X-Gal/IPTG），待胶表面没有液体流动时，37℃温箱倒置培养12-16hr。

6．放于4℃数小时，使显色完全（带有重组质粒转化子由于丧失了β半乳糖苷酶活性，为白色菌落，而没有携带重组质粒转化子的为蓝色菌落）。

学时分配：

实验一：

植物基因组DNA的分离，4个学时；

实验二：

质粒DNA的提取，3个学时；

实验三：

琼脂糖凝胶电泳检测DNA，3个学时；

实验四：

RAPD-PCR技术，6个学时；

实验五：

大肠杆菌感受态细胞的制备，6个学时；

实验六：

重组质粒的连接．转化及筛选，12个学时。

考核方式：

实验操作加实验报告（各50%）