届高考生物二轮专题复习 专题十三 基因工程及其应用教师用.docx
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届高考生物二轮专题复习专题十三基因工程及其应用教师用
专题十三基因工程及其应用教师用
知识点一 基因工程的基本操作工具
1．限制性核酸内切酶
（1）来源：
主要从原核生物中分离纯化而来。
（2）作用：
识别特定的核苷酸序列并切开相应两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
（3）结果：
产生黏性末端或平末端。
2．DNA连接酶
常用类型
E·coliDNA连接酶
T4DNA连接酶
来源
大肠杆菌
T4噬菌体
功能
连接黏性末端
连接黏性末端和平末端
结果
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
3.载体
（1）常用载体——质
粒
（2）其他载体：
λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。
知识点二 基因工程的操作步骤[动漫演示更形象 见课件光盘]
（1）
方法
（2）
组成
（3）
方法
（4）
方法
一、理解运用能力
判断有关基因工程叙述的正误。
（1）限制酶只能用于切割目的基因（×）
（2）DNA连接酶能将两碱基间通过形成氢键连接起来（×）
（3）E·coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端（×）
（4）质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体（√）
（5）载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达（√
）
（6）利用PCR技术能合成目的基因（√）
（7）目的基因导入双子叶植物一般采用农杆菌转化法（√）
（8）检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原—抗体杂交技术（×）
（9）蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质（√）
（10）蛋白质工程的操作对象是蛋白质分子（×）
二、读图析图能力
据农杆菌转化法示意图回答下列问题：
（1）农杆菌Ti质粒中T－DNA具有怎样的特点？
答案：
能转移到受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。
（2）农杆菌转化法的基本原理是什么？
答案：
利用农杆菌T－DNA的可转移性，将目的基因插入T－DNA上通过农杆菌的转化，将目的基因导入受体细胞，并整合到植物细胞的染色体上。
（3）农杆菌转化法主要适用于哪类植物？
答案：
双子叶植物和裸子植物。
[理清脉络]
考点一|基因工程的操作工具
1．限制性核酸内切酶
GC
GC
CG
CG
（1）识别序列的特点：
呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。
如
以中心线为轴，两侧碱基互补对称；
以
为轴，两侧碱基互补对称。
（2）切割后产生末端的种类——黏性末端和平末端。
当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的是平末端。
2．限制酶与DNA连接酶的关系
3．载体具备的条件
条件
适应性
稳定并能复制
目的基因稳定存在且数量可扩大
有一个至多个限制酶切割位点
可携带多个或多种外源基因
具有特殊的标记基因
便于重组DNA的鉴定和选择
[典例1] 基因工程利用某目的基因（图甲）和Pl噬菌体载体（图乙）构建重组DNA。
限制性核酸内切酶的酶切位点分别是BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ。
下列分析错误的是（ ）
A．构建重组DNA时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因所在片段和Pl噬菌体载体
B．构建重组DNA时，可用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因所在片段和Pl噬菌体载体
C．图乙中的Pl噬菌体载体只用EcoRⅠ切割后，含有2个游离的磷酸基团
D．用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和Pl噬菌体载体，再用DNA连接酶连接，只能产生一种重组DNA
[解析] 由题图可知，BglⅡ、Sau3AⅠ及EcoRⅠ三种酶在目的基因和Pl噬菌体上都有切口，故可用BglⅡ和Sau3AⅠ或EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因所在片段和Pl噬菌体载体；从图乙知Pl噬菌体载体为环状DNA，只用EcoRⅠ切割后产生两条反向双螺旋链状DNA，有2个游离的磷酸基团；用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和Pl噬菌体载体，再用DNA连接酶连接，能产生不止一种重组DNA。
[答案] D
1．基因工程的理论基础
2．几种酶的比较
比较
项目
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
解旋酶
作用
底物
DNA分子
DNA分子片段
脱氧核苷酸
DNA分子
作用
部位
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
碱基对间的氢键
作用
结果
形成黏性末
端或平末端
形成重组
DNA分子
形成新的
DNA分子
形成单链
DNA分子
[针对练习]
下列关于基因工程中有关酶的叙述不正确的是（ ）
A．限制酶水解相邻核苷酸间的化学键切断DNA
B．DNA连接酶可将末端碱基互补的两个DNA片段连接起来
C．DNA聚合酶能够从引物末端延伸DNA或RNA
D．逆转录酶以一条RNA为模板合成互补的DNA
解析：
选C DNA聚合酶只能从引物末端延伸DNA而不能延伸RNA；限制酶可水解相邻核苷酸间的化学键，切断DNA；DNA连接酶可将末端碱基互补的两个DNA片段连接起来；逆转录酶以一条RNA为模板合成互补的DNA。
考点二|基因工程的操作过程
1．目的基因的获取
（1）直接分离
（2）人工化学合成：
适用于分子较小的基因。
2．基因表达载体的构建
（1）基因表达载体的组成
（2）构建过程：
重组DNA分子
（重组质粒）
3．将目的基因导入受体细胞
生物
种类
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用
方法
农杆菌转化法
显微注射技术
感受态细胞法
受体
细胞
体细胞
受精卵
原核细胞
转化
过程
将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体
DNA上→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
4．目的基因的检测与鉴定
[典例2] 浙江大学农学院喻景权教授课题组研究发现，一种植物激素——油菜素内酯能促进农药在植物体内的降解和代谢。
用油菜素内酯处理后，许多参与农药降解的基因（如P450基因和红霉素抗性基因）表达和酶活性都得到提高，在这些基因“指导”下合成的蛋白酶能把农药逐渐转化为水溶性物质或低毒甚至无毒物质，有的则被直接排出体外。
某课题组进一步进行了如下的实验操作，请回答下列问题：
（1）获得油菜素内酯合成酶基因的方法有____________、____________。
步骤①用PCR技术扩增基因时用到的耐高温酶通常是指________________；步骤②用到的酶有________________。
（2）图中导入重组质粒的方法是________，在导入之前应用________处理受体细菌。
（3）导入重组质粒2以后，往往还需要进行检测和筛选，可用________制成探针，检测是否导入了重组基因，在培养基中加入________可将含有目的基因的细胞筛选出来。
（4）请为该课题命名：
_____________________________________________________。
[解析] 进行基因工程操作时，首先要获取目的基因，其方法有多种：
从基因文库中获取、人工合成目的基因或PCR合成等。
在构建基因表达载体的过程中，用到的工具酶有限制酶和DNA连接酶。
图中的受体细胞是细菌，故用转化法导入表达载体，导入后，需检测和筛选。
从图中可以看出，最终是通过对照实验来检验转基因细菌对土壤中残留农药的分解能力。
[答案]
（1）从基因文库中获取 人工合成目的基因或PCR合成 耐热的DNA聚合酶 限制酶和DNA连接酶
（2）转化法 氯化钙溶液 （3）红霉素抗性基因 红霉素 （4）油菜素内酯能否促进土壤中农药的分解
1．限制酶剪切目的基因与
质粒的次数不同
获取一个
目的基因需限制酶剪切2次，共产生4个黏性末端或平末端，切割质粒则只需要限制酶剪切1次，因为质粒是环状DNA分子，而目的基因在DNA分子链上。
2．目的基因的插入位点不是随意的
基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。
3．基因工程操作过程中只有第三步没有碱基互补配对现象
第一步存在逆转录法获得DNA，第二步存在黏性末端连接现象，第四步存在检测分子水平杂交。
4．并非所有个体都可作为乳腺生物反应器
操作成功的应该是雌性个体，个体本身的繁殖速度较高，泌乳量、蛋白质含量等都是应该考虑的因素。
[课堂对点练]
题组一 基因工程的应用
1．（2013·广东高考）从某海洋动物中获得一基因，其表达产物为一种抗菌性和溶血性均较强的多肽P1。
目前在P1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的多肽药物，首先要做的是（ ）
A．合成编码目的肽的DNA片段
B．构建含目的肽DNA片段的表达载体
C．依据P1氨基酸序列设计多条模拟肽
D．筛选出具有优良活性的模拟肽作为目的肽
解析：
选C 该基因的表达产物多肽P1的抗菌性和溶血性均很强，要研发出抗菌性强但溶血性弱的多肽药物，首先应根据P1的氨基酸序列设计模拟肽，再构建相应的DNA片段。
2．（2011·四川高考）北极比目鱼中有抗冻基因，其编码的抗冻蛋白具有11个氨基酸的重复序列，该序列重复次数越多，抗冻能力越强。
下图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图，有关叙述正确的是（ ）
A．过程①获取的目的基因，可用于基因工程和比目鱼基因组测序
B．将多个抗冻基因编码区依次相连成能表达的新基因，不能得到抗冻性增强的抗冻蛋白
C．过程②构成的重组质粒缺乏标记基因，需要转入农杆菌才能进行筛选
D．应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达
解析：
选B 过程①中通过逆转录法获得的目的基因，可用于基因工程，但该目的基因不存在内含子和非编码序列，因此不能用于比目鱼的基因组测序；将多个抗冻基因编码区相连形成的能表达的新基因可能不再是抗冻基因；利用农杆菌的目的是将重组质粒导入受体细胞，而不是筛选重组质粒；应用DNA探针技术，可以检测受体细胞中是否成功导入了目的基因，但不能检测目的基因是否完全表达。
题组二 基因工程的工具及操作程序
3．（2013·江苏高考）小鼠杂交瘤细胞表达的单克隆抗体用于人体试验时易引起过敏反应，为了克服这个缺陷，可选择性扩增抗体的可变区基因（目的基因）后再重组表达。
下列相关叙述正确的是（多选）（ ）
A．设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列
B．用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列
C．PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶
D．一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞
解析：
选BD 设计引物时应当考虑由此扩增的目的基因与载体两端的序列进行互补配对；PCR体系中应用耐高温的DNA聚合酶，而不是从受体细胞中提取的普通DNA聚合酶。
4．（2012·浙江高考）天然的玫瑰没有蓝色花，这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因B，而开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因B，现用基因工程技术培育蓝玫瑰，下列操作正确的是（ ）
A．提取矮牵牛蓝色花的mRNA，经过逆转录获得互补的DNA，再扩增基因B
B．利用限制性核酸内切酶从开蓝色花牵牛的基因文库中获取基因B
C．利用DNA聚合酶将基因B与质粒连接后导入玫瑰细胞
D．将基因B直接导入大肠杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞
解析：
选A 获取的基因B，可先提取矮牵牛蓝色花的mRNA，经逆转录获得
互补的DNA，再经PCR技术扩增；基因文库构建时是将目的基因与载体连接起来，形成重组载体，再导入受体菌中储存和扩增，提取目的基因时不需使用限制酶；连接目的基因与质粒的酶是DNA连接酶；将目的基因导入植物细胞，常用农杆菌转化法，不使用大肠杆菌。
5．（2012·江苏高考）下图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。
现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。
请回答下列问题：
（1）图1的一条
脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由________________连接。
（2）若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是________末端，其产物长度为________________________________________________________________________。
（3）若图1中虚线方框内的碱基对被T－A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。
从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有________种不同长度的DNA片段。
（4）若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是________。
在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加________的培养基进行培养。
经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是__________________________________________
____________________________________。
解析：
（1）一条脱氧核苷酸链中相邻的两个碱基之间是通过“—脱氧核糖—磷酸—脱氧核糖—”相连的。
（2）从SmaⅠ的识别序列和酶切位点可知，其切割后产生的是平末端，图1中DNA片段有两个SmaⅠ的识别序列，故切割后产生的产物长度为534＋3＝537（bp）、796－3－3＝790（bp）和658＋3＝661（bp）的三个片段。
（3）图示方框内发生碱基对的替换后，形成的d基因失去了1个SmaⅠ的识别序列，故D基因、d基因用SmaⅠ完全切割所得产物中除原有D基因切割后的3种长度
的DNA片段外，还增加一种d基因被切割后出现的长度为537＋790＝1327（bp）的DNA片段。
（4）目
的基因的两端都有BamHⅠ的识别序列，质粒的启动子后抗生素A抗性基因上也有BamHⅠ的识别序列，故应选用的限制酶是BamHⅠ，此时将抗生素B抗性基因作为标记基因，故筛选时培养基中要添加抗生素B。
经过同种限制酶切割后会产生相同的未端，部分目的基因与质粒反向会连接而导致基因无法正常表达。
答案：
（1）脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖
（2）平 537bp、790bp、661bp
（3）4
（4）BamHⅠ 抗生素B 同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接
[课下提能练]
一、选择题
1．下列有关基因工程的说法正确的是（ ）
A．如果某种生物的cDNA文库中的某个基因与该生物的基因组文库中的某个基因控制的性状相同，则这两个基因的结构也完全相同
B．一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子、终止密码子和标记基因
C．目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化
D．将目的基因导入植物细胞和动物细胞的常用方法是显微注射法
解析：
选C cDNA是由mRNA反转录得到的，由于mRNA缺乏内含子和启动子，所以即使某生物的cDNA文库中的某个基因与该生物的基因组文库中的某个基因控制的性状相同，这两个基因的结构也可能是不相同的。
基因表达载体包括启动子、目的基因、标记基因、终止子，而终止密码子存在于mRNA上。
将目的基因导入植物细胞通常用农杆菌转化法，导入动物细胞用显微注射法。
2．下面是3种限制性核酸内切酶对DNA分子的识别序列和剪切位点图（箭头表示切点，切出的断面为黏性末端）。
相关叙述错误的是（ ）
限制酶1：
——↓GATC——
限制酶2：
——CCGC↓GG——
限制酶3：
——G↓GATCC——
A．不同的限制酶有不同的识别序列和切割位点，体现了酶的专一性
B．限制酶2和3识别的序列都包含6个碱基对
C．限制酶1和酶3剪出的黏性末端相同
D．能够识别和切割RNA分子内一小段核苷酸序列的酶只有限制酶2
解析：
选D 不同限制酶有不同的识别序列和切割位点，体现了酶具有专一性；限制酶2和3识别序列分别是CCGCGG和GGATCC，均为6个碱基对；限制酶1和3剪出的黏性末端相同；三种限制酶均不能识别和切割RNA中核糖核苷酸序列。
3．下图表示用化学方法合成目的基因Ⅰ的过程。
据图分析下列叙述正确的是（ ）
A．过程①需要DNA连接酶
B．过程②需要DNA限制性核酸内切酶
C．目的基因Ⅰ的碱基序列是已知的
D．若某质粒能与目的基因Ⅰ重组，则该质粒和目的基因Ⅰ的碱基序列相同
解析：
选C 题图所示为化学方法合成目的基因的过程。
①②过程依赖碱基互补配对原则进行。
质粒和目的基因的碱基序
列一般不相同。
4．科学家采用基因工程技术将矮牵牛中控制蓝色色素合成的基因a转移到玫瑰中，以培育蓝玫瑰，下列操作正确的是（ ）
A．利用DNA分子杂交技术从矮牵牛的基因文库中获取基因a
B．用氯化钙溶液处理玫瑰叶肉细胞，使其处于感受态
C．用含四环素的培养基筛选转基因玫瑰细胞
D．将基因a导入玫瑰细胞液泡中，防止其经花粉进入野生玫瑰
解析：
选A 将目的基因导入微生物细胞时，用氯化钙溶液处理受体细胞，可使其处于感受态，利于目的基因的导入。
将目的基因导入玫瑰叶肉细胞的叶绿体基因组中，可防止其经花粉进入野生玫瑰，液泡中无DNA。
5．（2014·雅礼中学摸底）将乙肝抗原基因导入到酵母菌中，通过发酵能大量生产乙肝疫苗。
下列叙述正确的是（ ）
A．目的基因在酵母菌中表达出抗体
B．目的基因的表达需要线粒体提供能量
C．构建基因表达载体时需用限制性核酸内切酶和DNA聚合酶
D．受体菌内目的基因的转录和翻译发生在同一场所
解析：
选B 目的基因成功导入到酵母菌后可以表达出乙肝疫苗，但不是表达出抗体；目的基因通过转录和翻译过程表达出产物，需要消耗能量，可以由线粒体提供；构建基因表达载体时需用限制性核酸内切酶和DNA连接酶；由于受体菌酵母菌属于真核生物，故目的基因的转录和翻译场所不同。
6．草甘膦是一种可以杀灭多种植物（包括农作物）的除草剂。
草甘膦杀死植物的原理在于能够破坏植物叶绿体或质体中的EPSPS合成酶。
通过转基因的方法，让农作物产生更多的EPSPS酶，就能抵抗草甘膦，从而让农作物不被草甘膦杀死。
下列有关抗草甘膦转基因大豆的培育分析正确的是（ ）
A．可通过喷洒草甘膦来检验转基因大豆是否培育成功
B．只能以大豆受精卵细胞作为基因工程的受体细胞
C．在转基因操作过程中一定要用同一种限制性核酸内切酶
D．只要EPSPS合成酶基因进入大豆细胞，大豆就会表现出抗草甘膦性状
解析：
选A 可通过喷洒草甘膦来检验转基因大豆是否培育成功；转基因植物也可用植物体细胞作为受体细胞；转基因操作时不一定要用同一种限制酶；基因成功转入后，性状不一定能够成功表达，还需要进一步检测。
7．某线性DNA分子含有5000个碱基对（bp），先用限制性核酸内切酶a完全切割，再把得到的产物用限制性核酸内切酶b完全切割，得到的DNA片段大小如下表所示。
限制性核酸内切酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。
下列有关叙述错误的是（ ）
a酶切割产物（bp）
b酶再次切割产物（bp）
2100；1400
1000；500
1900；200；800
600；1000；500
A．a酶与b酶切断的化学键相同
B．限制性核酸内切酶a和b切出的DNA片段不能相互连接
C．该DNA分子中含有被a酶识别的碱基序列有3处
D．仅用b酶切割该DNA分子可得到3种DN
A片段
解析：
选B a酶与b酶切断的化学键均为磷酸二酯键。
图示两种酶切割DNA得到的末端碱基序列均为GATC，故可以相互连接。
表格显示a酶切割该DNA分子得到4个片段，说明该DNA分子含有被a酶识别的碱基序列有3处。
对比a酶单独作用与a、b联合作用得到的DNA片段知：
仅用b酶切割该DNA分子可得到3种DNA片段。
8．许多大肠杆菌的质粒上含有lacZ基因，其编码的产物β 半乳糖苷酶在Xgal和IPTG存在时，可以产生蓝色沉淀，使菌落呈现蓝色，否则菌落呈现白色。
基因工程中常利用该原理从导入质粒的受体细胞中筛选出真正导入重组质粒的细胞，过程如下图所示。
下列说法错误的是（ ）
A．基因工程中，构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，能遗传给后代，并表达和发挥作用
B．转化过程中，大肠杆菌应先用Ca2＋处理，使其处于能吸收周围DNA的状态
C．菌落颜色为白色的是菌落②
D．菌落③中的目的基因是否表达，可采用的检测办法是抗原—抗体杂交
解析：
选C 基因工程中，构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，能遗传给后代，并表达和发挥作用。
转化过程中，大肠杆菌应先用Ca2＋处理，使其处于能吸收周围DNA的状态。
lacZ标记基因因外源基因的插入而不能表达出β 半乳糖苷酶，故菌落③为白色菌落。
可采用抗原—抗体杂交的方法检测菌落③中的目的基因是否表达。
二、非选择题
9．（2014·马
鞍山质检）绞股蓝细胞中含有抗烟草花叶病毒（TMV）基因，可以合成一种抗TMV蛋白，叶片对TMV具有抗感染性。
烟草是重要的经济作物，由于TMV的感染会导致大幅度减产。
研究人员利用转基因技术培育出了抗TMV的烟草，主要流程如下图所示：
（1）科学家首先从绞股蓝细胞中提取抗TMV基因转录的RNA，然后合成目的基因。
图中过程①表示______
__。
（2）由图分析，在过程③构建的重组Ti质粒上应该含有的标记基因是________基因，重组Ti质粒导入烟草体细胞的常用方法是____________________。
（3）在过程⑤培养基中除含有卡那霉素及植物必需的各种营养成分外，还必须添加________，以保证受体细胞能培养成再生植株。
（4）过程⑥可采取________的方法，检测植株是否合成了抗TMV蛋白。
在个体水平的鉴定过程中，可通过________的方法来确定植株是否具有抗性。
解析：
（1）由图可知，过程①表示逆转录（或反转录）。
（2）由图示过程⑤培养基中含有卡那霉素可知，Ti质粒上的标记基因是卡那霉素抗性基因，将基因表达载体（重组Ti质粒）导入植物细胞中常用的方法是农杆菌转化法。
（3）将受体细胞培养成再生
植株需要进行植物组织培养，培养基中除含有卡那霉素及植物必需的各种营养成分外，还必须添加植物激素。
（4）通过抗原—抗体杂交的方法，可检测植株是否合成了抗TMV蛋白；在个体水平上，通过接种烟草花叶病毒的方法可以确定植株是否具有抗性。
答案：
（1）逆转录
（2）卡那霉素抗性 农杆菌转化法
（3）植物激素
（4）抗原—抗体杂交 接种烟草花叶病毒
10．（2014·日照一模）我们日常吃的大米中铁含量极低，科研人员通过基因工程等技术，培育出了铁含量比普通大米高60%的转基因水稻，改良了稻米的营养品质。
下面为培育转基因水稻过程示意图，请回答：
（1）在上述工程中，铁结合蛋白基因称为________，获取该基因后常用________技术进行扩增。
（2）构建重组Ti质粒时，通常要用同种限制酶分别切割________和________。
将重组Ti质粒转入农杆菌时，可以用_____
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