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无菌检查验证

无菌检查验证方案

编制：

日期：

审核：

日期：

批准：

日期：

文件编号：

文件受控：

XXXX有限公司

年月日

无菌检查验证方案

验证方案：

一．验证目的：

确认供试品所采用的检查方法和检查条件下无抑菌作用，以保证微生物的充分检出，确保检验方法科学性、检验结果准确性。

二．.验证依据：

GB/T14233.2—2005医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：

生物学试验方法

《中国药典》2010版

三．.验证频次：

检验条件发生改变时、检验方法发生改变时、检验人员发生改变时、进行再验证，如果一切都没发生改变时一年进行一次。

四．职责：

4.1生产技术部制定验证方案。

4.2质量部按照验证方案执行。

五．.验证小组成员：

组长：

组员：

六．实施日期：

七.资料保存：

由质管科保存5年。

八．.检验方法：

1.无菌室消毒：

如果无菌室很久没有使用，在使用之前用乳酸或甲醛消毒，正常使用化验室的情况下，每月要消毒一次，使用六个月要更换消毒剂，按消毒剂的说明书的浓度、时间、方法进行消毒，化验员对地面进行消毒清擦，工作台面用75%的酒精进行消毒，在化验员进入之前，紫外线照射30min,在开启空调30min。

2.化验员进入化验室过程：

化验员在一更除去外衣进入洁净间进行洗手间洗手、手消毒、穿洁净工作服，进入二更、缓冲间、进入准备间，在准备间穿无菌工作服进入菌检室。

3.主要设备：

超净工作台，光学显微镜、恒温培养箱、恒温水浴箱、压力蒸汽灭菌器、电热干燥箱。

4.培养基配制及灭菌、器具灭菌.

①营养肉汤培养基的制备及灭菌，按照说明书制备培养基及灭菌。

②流体硫乙醇酸盐培养基制备及灭菌，按照说明书制备及灭菌。

③改良马丁培养基制备及灭菌，按照说明书制备及灭菌。

④接触的器具采用可靠的灭菌方法，置压力蒸汽灭菌器内121℃，30分钟，或置于电热干燥箱里180℃，2小时。

5.无菌室检查：

直径为9厘米培养皿，无菌操作注入融化的营养琼脂培养基约15mL--20mL,在30℃--35℃培养48小时，3只培养基在无菌室操作台平均位置打开盖，暴露30分钟后盖好盖，倒置30℃---35℃培养48小时后取出检查，3只培养基上生长的菌落数平均应不超过1个。

6.培养基无菌检查：

每批培养基随机抽取不少于10只，5支置于30℃---35℃，另取5支置于20℃---25℃培养14天，均应无菌生长。

检查可在供试品无菌检查前或和供试品的无菌检查同时进行。

7.培养基的灵敏度检查

培养基灵敏度检查用菌株传代次数不得超过5代，试验用枯草芽孢杆菌种应采用适宜的菌种保存技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特征。

⑴菌液制备：

接种枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中（或营养琼脂培养基上）在30°C--35°C培养18小时至24小时，培养物用0.9%氯化钠溶液，每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液，菌悬液在室温下放置2小时内使用。

⑵培养基接种：

取3支管，每管装12ml的硫乙醇酸盐流体培养基，其中2管接种小于100cfu枯草芽孢杆菌，另1支管做空白对照液，置30°C---35°C培养3天，结果判定，空白对照管应无菌生长，加菌的培养基均生长良好，判该营养基的灵敏度检查符合规定。

8.无菌检查：

将灭好的生物指示剂用无菌操作法，将其放入装有10ml营养肉汤培养基的试管中，每个生物指示剂放入一个试管中，其中有一试管的培养基作空白对照液，再取一试管营养肉汤培养基放入没灭菌的枯草杆菌芽孢菌片，作为阳性对照，置入33°C-37°C培养7天，逐日观察，并记录是否有菌生长。

如果加灭好生物指示剂在培养过程中，培养基出现浑浊，不能从外观上判断有无菌生长，可取该培养液适量转种至新鲜的营养肉汤培养基中及营养琼脂斜面上33°C-37°C培养2天，观察是否有菌生长或取培养（物）涂片，染色，镜检，判断是否有菌，必要时作菌种鉴定。

9.结果判断：

阳性对照管的菌应生长良好，阴性对照管不得有菌生长，否则，试验无效。

若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判定供试品符合规定。

若供试品管中任何一管浑浊并证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含，试验若经确认无效，应重试。

10.重试的过程：

①产品数量：

同一批号10支单位产品。

②浸提介质：

质量浓度9g/L无菌氯化钠。

③供试液制备：

管类器具：

按管内表面积每10cm2加入提介质1ml，振摇数次，流量约为10ml/min,容器类器具：

按容器内表面积每10cm2加入提介质1ml，振摇数次。

④培养基的无菌检查：

每批培养基随机抽取不少于10支，5支置

30°C-35°C，另5支置20°C-25°C培养14天，均无菌生长，检查可在供试品无菌检查前或和供试品的无菌检查同时进行。

⑤供试品有无抑菌作用

取硫乙醇酸盐流体培养基8管，分别接入小于100cfu的金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，枯草芽孢杆菌，生胞梭菌各2管，取改良马丁培养基4管，每管装置10ml，小于100cfu的白色念球菌，黑曲霉各2管。

其中1管接入1ml供试液，另1管作为对照。

细菌置30°C-35°C，真菌置20°C-25°C培养3天至5天，逐日观察菌的生长情况，结果判断：

与对照管比较，如含供试品各管试验菌生长良好，则说明供试品该检验量在该检验条件下无抑菌作用或抑菌作用可以忽略不计，照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查。

如含供试品的任何一种管试验菌生长微弱，缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该条件下有抑菌作用，可采用增加冲洗量，增加培养基用量，使用中和剂消除供试品抑菌作用。

⑥灵敏度检查：

菌种：

培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）{CMCC（B）26003}

铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）{CMCC（B）10104}

枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）{CMCC（B）63501}

生胞梭菌（Clostridiumsporogenes）{CMCC（B）64941}

白色念球菌（Candidaalbicans）{CMCC（B）98001}

黑曲霉（Aspergillusniger）{CMCC（B）98003}

菌液制备：

接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生胞梭菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基中，30°C-35°C培养18小时至24小时；接种白色念球菌的新鲜培养物至至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，20°C-25°C培养24小时至48小时，上述培养物用0.9%氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于10cfu（菌落形成单位）的菌悬液。

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基上，23°C-28°C培养5天~7天，加入3ml~5ml无菌的含0.05%（v/v）聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。

菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2°C-8°C可在24小时内使用。

黑曲霉孢子悬液可保存在2°C-8°C，在验证过的贮存期内使用。

培养基接种：

取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生胞梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，置30°C-35°C培养3天；取每管装置为9ml的改良马丁培养基5支，分别接种小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，置30°C-35°C培养3天，取每管装置为9ml的改良马丁培养基5支，分别接种小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，置20°C-25°C培养5天。

逐日观察结果。

结果判定：

空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，

判该培养基的灵敏度检查符合规定。

⑦供试品接种培养和观察

接种6支试管，其中4管装硫乙醇酸盐流体培养基每管装置15ml，另2管装改良马丁培养基每管装置10ml，在6支试管中分别接入1ml供试液，同时作阳性对照和阴性对照。

培养及观察：

将上述接种后的硫乙醇酸盐流体培养基平均分成两份，一份置30°C-35°C培养14天，另一份与接种后的改良马丁培养基置20°C-25°C培养14天，培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长，如在加入供试液后或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无菌生长，可取该培养液适量的转种至同种新鲜培养基中及营养琼脂斜面和改良马丁琼脂斜面培养基上，细菌培养2天，真菌培养3天，观察接种的同种新鲜培养基及营养琼脂和改良马丁琼脂斜面培养基上是否有菌生长或培养液（物）涂片，染色，镜检，判断是否有菌，必要时作菌种鉴定。

结果判断：

阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长，否则，试验无效。

若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确定无菌生长，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。

当符合下列至少一个条件时方可判试验结果无效；

⑴无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。

⑵回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。

⑶供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。

试验若经确认无效，应重试。

重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。

产品留样无菌检查按此方法执行，第一次试验，可再重复试验一次，若合格，则合格，再次长菌为不合格。

验证方案的实施

1.按照验证方案进行消毒、按照人员进入程序进入。

以三个批号的产品为例进行验证。

2.以一次性使用输液器带针，规格/型号:

IS-G0.55*21（mm）,生产批号：

20120402灭菌批号：

20120403A1，灭菌批量,31332套;一次性使用输液器带针,规格/型号:

IS-G0.60*24（mm）,生产批号20120406，灭菌批号：

20120407A1生产批量31332套;一次性使用输液器带针，生产批号20120411,灭菌批号：

20120412A1,规格/型号:

IS-G0.7*25（MM），生产批量31332为例：

A.培养基无菌检查：

A1培养基的制备：

营养肉汤培养基：

生产企业：

北京奥博星生物技术有限责任公司，批号20130218\2013.03.25取营养肉汤培养基18克，加入到蒸馏水1000毫升，加热煮沸溶解，调节PH值，分装每管装10ML营养肉汤培养基，121℃在高压灭菌锅内灭菌15分钟备用。

A2培养基无菌检查：

2013.03.25将灭好的5管培养基10ml营养肉汤培基置入36°C培养7天，逐日观察，均无菌生长。

B.培养基的灵敏度检查

培养基灵敏度检查用菌株传代次数不得超过5代，试验用枯草芽孢杆菌种应采用适宜的菌种保存技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特征。

⑴菌液制备：

2012.03.25接种枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中在34°C培养24小时，培养物用0.9%氯化钠溶液稀释，每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液，菌悬液在室温下放置2小时内使用。

⑵培养基接种：

取3支管，每管装10ml的营养肉汤培养基，其中2管接种小于100cfu枯草芽孢杆菌，另1支管做空白对照液，置34°C培养3天，结果判定，空白对照管无菌生长，加菌的培养基均生长良好，该营养基的灵敏度检查符合规定。

C.无菌检查：

将灭好的生物指示剂用无菌操作法，将其放入装有10ml营养肉汤培养基的试管中，每个生物指示剂放入一个试管中，其中有一试管的培养基作空白对照液，再取一试管营养肉汤培养基放入没灭菌的枯草杆菌芽孢菌片，作为阳性对照，置入36°C培养7天，逐日观察，并记录是否有菌生长。

结果判断：

阳性对照管的菌应生长良好，阴性对照管不得有菌生长，否则，试验无效。

若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判定供试品符合规定。

枯草杆菌黑色芽胞变种培养记录

序号：

记录编号：

AF-JL8.2.4-008

产品名称

一次性使用输液器带针

菌片名称

枯草芽胞杆菌ATCC9372

规格型号

IS-G0.55X21（mm）

菌片批号

20120818

生产批号及批量

2013040231332套

菌片数

11片

灭菌批号

20130403A1

培养基名称

营养肉汤培养基

灭菌数量

31332套

检验日期

2013.04.03—03.10

培养温度

37℃

无菌室菌落数

接种

管号

阳性

阴性

培养温度

37℃

培养天数及结果

—

碟号

—

24h菌落数

—

48h菌落数

—

平均数

—

结

果

判

定

无菌室合格

—

检验人：

复核人：

XXXX有限公司

枯草杆菌黑色芽胞变种培养记录

序号：

记录编号：

AF-JL8.2.4-008

产品名称

一次性使用输液器带针

菌片名称

枯草芽胞杆菌ATCC9372

规格型号

IS—G0.6X24（mm）

菌片批号

20120818

生产批号及批量

2013040631332套

菌片数

11片

灭菌批号

20130407A1

培养基名称

营养肉汤培养基

灭菌数量

31332套

检验日期

2013.04.07—04.14

培养温度

37℃

无菌室菌落数

接种

管号

阳性

阴性

培养温度

37℃

培养天数及结果

—

碟号

—

24h菌落数

—

48h菌落数

—

平均数

—

结

果

判

定

无菌室合格

—

检验人：

复核人：

XXXX有限公司

枯草杆菌黑色芽胞变种培养记录

序号：

记录编号：

AF-JL8.2.4-008

产品名称

一次性使用输液器带针

菌片名称

枯草芽胞杆菌ATCC9372

规格型号

IS—G0.7X25（mm）

菌片批号

20120818

生产批号及批量

2013041131332套

菌片数

11片

灭菌批号

20130412A131332套

培养基名称

营养肉汤培养基

灭菌数量

31332套

检验日期

2013.04.12-04.19

培养温度

37℃

无菌室菌落数

接种

管号

阳性

阴性

培养温度

37℃

培养天数及结果

—

碟号

—

24h菌落数

—

48h菌落数

—

平均数

—

结

果

判

定

无菌室合格

—

检验人：

复核人：

XXXX有限公司

九．无菌试验另一种方法：

1.改良马丁培养基：

生产企业;北京奥博星生物技术有限责任公司，批号：

硫乙醇酸盐流体培养基：

生产企业;北京奥博星生物技术有限责任公司，批号：

2.按照无菌验证方案进行无菌车间消毒，人员进出程序进入。

3.具体检验方法：

①产品数量：

取一次性使用无菌注射器带针，规格/型号：

2ML0.5（MM）生产批号：

20130105，生产批量4800支，灭菌批号：

20130106灭菌批量：

4800支，取10支单位产品。

规格/型号：

5ML0.6（MM）生产批号：

20080618，生产批量40000支，灭菌批号：

20130619灭菌批量：

40000支，取10支单位产品。

规格/型号：

5ML0.6（MM）生产批号：

20130701，生产批量50000支，灭菌批号：

20130702灭菌批量：

50000支，取10支单位产品。

②浸提介质：

质量浓度9g/L无菌氯化钠。

③供试液制备：

容器类器具：

按容器内表面积每10cm2加入提介质1ml，振摇数次。

④培养基的无菌检查：

2013.03.17A.取硫乙醇酸盐流体培养基29.2克加入1000毫升蒸馏水中，加热煮沸溶解，调PH值，分装，12ML装一管，115℃高压灭菌30分钟备用，每批培养基随机抽取不少于10支，5支置30°C-35°C，另5支置20°C-25°C培养14天，均无菌生长。

B.取改良马丁培养基29克加入1000毫升蒸馏水中，加热煮沸溶解，调PH值，分装，9ML装一管，115℃高压灭菌30分钟备用，每批培养基随机抽取不少于10支，置20°C-25°C培养14天，均无菌生长。

⑤供试品有无抑菌作用

2013.03.28.取硫乙醇酸盐流体培养基8管，分别接入小于100cfu的金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，枯草芽孢杆菌，生胞梭菌各2管，取改良马丁培养基4管，每管装置10ml，小于100cfu的白色念球菌，黑曲霉各2管。

其中1管接入1ml供试液，另1管作为对照。

细菌置35°C培养3天，真菌置25°C培养5天，逐日观察菌的生长。

结果判断：

与对照管比较，含供试品各管试验菌生长良好，则说明供试品该检验量在该检验条件下无抑菌作用或抑菌作用可以忽略不计，照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查。

⑥灵敏度检查：

菌种：

培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）{CMCC（B）26003}

铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）{CMCC（B）10104}

枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）{CMCC（B）63501}

生胞梭菌（Clostridiumsporogenes）{CMCC（B）64941}

白色念球菌（Candidaalbicans）{CMCC（B）98001}

黑曲霉（Aspergillusniger）{CMCC（B）98003}

菌液制备：

2013.03.26.接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，接种生胞梭菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，35°C培24小时；接种白色念球菌的新鲜培养物至至改良马丁培养基中25°C培养至48小时，上述培养物用0.9%氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于10cfu（菌落形成单位）的菌悬液。

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基上，28°C培养7天，加入3ml~5ml无菌的含0.05%（v/v）聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。

菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2°C-8°C可在24小时内使用。

黑曲霉孢子悬液可保存在2°C-8°C，在验证过的贮存期内使用。

培养基接种：

取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生胞梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，置35°C培养3天；取每管装置为9ml的改良马丁培养基5支，分别接种小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，置35°C培养3天，取每管装置为9ml的改良马丁培养基5支，分别接种小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，置25°C培养5天。

逐日观察结果。

结果判定：

空白对照管应无菌生长，加菌的培养基管均生长良好，

该培养基的灵敏度检查符合规定。

⑦供试品接种培养和观察

培养及观察：

将上述接种后的硫乙醇酸盐流体培养基平均分成两份，一份置35°C培养14天，另一份与接种后的改良马丁培养基置25°C培养14天，培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。

结果判断：

阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长，否则，试验无效。

无菌检验记录

序号：

AF-JL8.2.4-007

样品名称：

一次性使用无菌注射器带针规格型号：

2ML0.5MM生产批号：

生产批量：

4800支灭菌批号：

灭菌批量：

4800支

检验日期：

201304.03—04.17检验数量：

10支检验依据：

包装验证方案

培养

培养基名称

阳性

对照

阴性

对照

需气、厌气菌培养基

霉菌培养基

净化台菌落数

温度

30℃－35℃

20℃－25℃

培

养

温度

37℃

管号

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