临床诊断中聚合酶链反应PCR技术的应用.docx

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临床诊断中聚合酶链反应PCR技术的应用

WS/T230-2002临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用

Guidelinesforuseofpolymerasechainreaction

（PCR）techniqueinclinicaldiagnosis

1范围

   本标准规定了临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用准则。

   本标准适用于各级，各类的医疗、卫生、保健机构应用PCR技术进行临床诊断。

2定义

   本标准采用下列定义。

2.1引物primer

   与待扩增靶DNA片段两端互补的寡核昔酸，其本质是单链DNA（ssDNA），在DNA聚合酶的作用下能进行延伸，从而合成新的互补链。

2.2模板template

   待扩增的靶DNA或RNA链，包括人类基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、eDNA和mRNA、

扩增后的DNA产物等几乎所有形式的DNA或RNA。

2.3变性denaturation

   DNA或RNA由双链转变为单链状态，加热、提高pH或加入甲酰胺、脲等试剂都可使双链DNA或RNA发生变性。

2.4 退火annealing

   引物与互补的核苷酸序列在合适的温度下通过氢键形式相互结合的过程。

2.5 延伸 extension

   在合适的条件下，由DNA聚合酶（如：

Taq酶）催化引导引物DNA链延伸的合成过程。

2.6 污染 contamination

   由来源子非待测样品的核酸所引起的一个样品、一系列样品或试剂的非特异性扩增或扩增后在产物分析过程中造成的样品之间的污染，污染通常引起假阳性结果。

2.7 遗留污染 carry-overcontamination

   同一类靶序列上一次PCR扩增产物对以后扩增反应的后续污染。

2.8 内对照 internalcontrol

   在同一反应混合物体系中与待测靶核酸同时进行扩增反应的已知对照物。

2.9TaqDNA聚合酶 TaqDNApolymerase

   一种耐热的DNA聚合酶，最初是从美国黄石国家公园温泉中存在的水生栖热菌（Thermu$aquati-cus）中分离获得，Taq酶最适活性温度在70℃～80℃，能耐受PCR变性过程中的高温，是目前PCR扩增反应中经常使用的DNA聚合酶。

2.10抑制物／干扰物inhibition/interference

   临床样品中能导致假阳性或假阴性扩增的内源性物质（如血液中的某些成分，痰液中的酸性多糖、尿液、体液等）和外源性物质（如滑石粉、抗凝剂等）。

2.11 dNTPdeoxynueleotidetriphosphate

   三磷酸脱氧核苷，包括dATP、dUTP、dCTP、dGTP、dTTP等。

在PCR扩增反应中，作为反应底物聚合形成新的DNA链。

2.12热循环仪thermocycler

   在PCR或其他需要在反应过程中转换温度的体系中用来保证温度准确快速转换的设备。

3用途

   对目前已有稳定、可靠的微生物学和免疫学方法检测的疾病或病原体，不推荐应用PCR进行检测。

例如，大多数的细菌感染通过细菌培养3～4天即可报告并明确药敏结果；对甲型肝炎病毒等的感染。

通过对其抗原或／和抗体的检测也可明确诊断。

对于目前尚无其他实验室诊断技术或现有的诊断技术不成熟、敏感性太低、不能及时准确地反映感染情况的疾病，可推荐应用PCR技术进行检测。

如丙型肝炎病毒的感染，检测其抗体不能做到早期诊断、也不能表明血清中有无病毒的存在，又如结核杆菌的感染，培养需2～3个月，耗时太长，影响诊断，对此类病原体，PCR检测有其独到的优点。

   PCR临床实验根据其应用的不同可分为三个互相交叉的类型t“过筛实验”，“诊断实验”、“验证实验”。

3.1过筛实验

   过筛实验适用于数目较大的群体，可能大部分元症状（疾病的流行性可能很低）。

一个阳性结果并不能确定病原微生物的流行或反映某种疾病状态，它只能提示有必要作进一步的检测。

较高的诊断敏感性和阴性可信度是过筛实验最重要的特性。

3.2诊断实验

   诊断实验用于当地某种疾病流行率很高、疑诊患有某种疾病（或特异性感染）的群体，特异性靶基因（或病原体）的有无对诊断和治疗有重要意义。

因此，要求在保证实验特异性的情况下-敏感性尽可能地高。

3.3验证实验

   对于过筛实验或诊断实验为阳性的情况，验证实验可作为其补充实验，用于确诊。

特异性和阳性可信度是验证实验最重要的特性。

4方法

4.1 引物序列的选择

   引物的设计是在模板序列中挑选出两段寡核苷酸片段，使其能有效地扩增模板。

模板序列的选择随着检测的不同而不同，但也有一些共同之处，如：

1）模板序列应是特异的-即不存在和其他序列同源的序列（尤其是在引物部分），模板序列的选择应避免核苷酸重复片段区I2）模板序列在某些情况下需要的是种属内部的保守区、非保守区（尤其是引物部分）或属内特异区。

   选择合适的引物是保证PCR扩增特异性和敏感性的关键。

首先，对应用于临床诊断的PCR。

在设计引物时，其靶核酸的序列一定是已知的，这些基因序列信息可从基因数据库（如GenBank）中获得。

虽然引物的设计在一定程度上依靠经验，尤其是目前已有多种计算机软件可应用于核苷酸的序列分析和PCR引物的设计，但引物的适用性尚需通过实验性研究加以确定。

PCR引物设计一般遵循以下基本原则：

   a）引物的长度一般为15～30个碱基；   

   b）两引物相距的距离以100～300核背酸为最优，这样可获得较佳的扩增效果；

   c）引物内碱基应尽可能随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶堆集现象，引物中G@C含量宜在40%～60%左右；

   d）引物内部不应有二级结构，两个引物之间、尤其在3’端的序列不应互补；

   e）引物3’端与模板一定要互补，末端碱基不要出现多个A。

4.2常规PCR实验方案

4.2.1材料

   模板DNA（102～105拷贝）

   上游引物

   下游引物

   TaqDNA聚合酶和浓缩反应缓冲液

   氯化镁（MgCl2）

   无DNA酶（DNase）的水

   无DNase矿物油

   dNTP混合物（含dATP、dCTP、dGTP、dTTP）

4.2.2扩增反应（一般情况下，每50μL反应体积所含组分如下）：

   成分                   终浓度

   无DNase的水     将反应体积补足至50μL

   浓缩反应缓冲液   1×工作浓度

   dNTP混合物      各0.2mmol/L

   TaqDNA聚合酶   0.5～1.0U/50μL

   氯化镁（MgCI2）   1.5mmol/L

   上游引物        1μmol/L

   下游引物        1μmol/L

   模板           102～105拷贝/50μL。

   每个反应管加1～2滴（20μL～40μL）无DNase的矿物油，根据适合各个PCR反应的扩增参数，按变性、退火、延伸三步骤的热循环程序进行扩增反应。

4.3PCR扩增产物的分析

   扩增产物的分析，根据研究对象和目的的不同可采用不同的分析方法，琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳等可帮助判断扩增产物的大小，有助于扩增产物的鉴定{点杂交还有助于对扩增产物进行基因分型（如HLA-DQ分型）；Southern杂交分析可从非特异扩增产物中鉴定出特异性产物的大小，因此，可增加检测的特异性和敏感性。

其他一些方法，如微孔板杂交、PCR-酶联免疫吸附实验（ELISA）等均有助于产物的精确分析。

4.3.1凝胶电泳

   这种方法是根据带负电的DNA可以在pH中性的缓冲液巾向阳极迁移的原理而建立的，凝胶基质可以是琼脂糖或聚丙烯酰胺等，核酸的迁移率与琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶的浓度、电流、离子强度以及温度等因素有关。

电泳后，通过溴化乙啶（EB）染色，在紫外下可以清晰地观察到PCR扩增产物条带，但扩增产物的特异性必须用探针杂交等方法加以鉴定。

4.3.2点杂交法

   点杂交法的基本过程是t首先将扩增产物固定到尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再用核素或非核索标记的探针进行杂交，由于核素有较大的放射危害性，现在多用非核索进行探针标记，如生物寨、荧光素、酶及化学发光剂等州玉可在反应时直接掺入地高辛或生物素标记的单核替酸，然后将扩增产物固定，再用抗地高辛抗体或亲合索进行反应来检设4靶序列。

4.3.3微孔板夹心杂交法

   该方法是通过固定子微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域进行特异性杂交，使扩增产物间接地固定于微孔板上，然后，再用生物泵等非核紊标记的检测探针与扩增产物的另一区域杂交，漂洗、显色后即可判断结果。

4.3.4PCR-ELISA

   将引物的5，端用生物素或异硫氰酸荧光素（FITC）等修饰后并不影响其扩增特异性靶核酸的特性，因此，可以通过修饰其中一个引物的5’端使其携带便于PCR产物被捕获、固定的功能基团（如生物紊）。

而通过另一引物5，端的修饰（如FITC）使产物便于检测，这样避免了电泳和杂交等步骤，适于常规检测。

4.3.5其他

   如限制性内切酶长度多态性分析（Restriction-fragment-length-polymorphism，RFLP）、核苷酸序列分析等。

5样品的收集、运输、处理和存放

   正确的样品收集、运送和保存是十分重要的。

虽然PCR检测对上述环节的要求与传统的微生物培养和血清学检测基本相同，但在许多情况下仍有其特殊性。

即无论在什么情况下都至少应保持靶核酸的完整性，样品中的干扰物应能被充分稀释，使其不致于干扰检测。

5.1样品的收集

   实验室对每项特定的PCR检测都应制定并为临床提供详细的样品收集规则。

5.1.1样品收集的时间

   在某一疾病的病程中，样品收集过早或过迟都会导致假阳性或假阴性结果，因此。

要注意样品收集的时限性或时效性。

5.1.2收集场所的准备

   样品的收集场所应要求避免细菌污染并去除可能造成污染的物质，样品的收集需由经过专门培训的工作人员来完成。

5.1.3样品的类型和数量

   样品的类型、数量应是一定的，它们可能与常规微生物学、血清学实验的要求相同或不同，这是由疾病病原体的不同特性决定的。

一般而亩，如果所收集的样品可以进行培养，那么提取核酸进行扩增分析也是可行的。

5.1.4样品的质量

   样品的质量可根据以下一种或几种方法进行评估：

肉眼观察、显微镜检查或化学分析。

评估其细胞组成、细胞数目、核酸总量等。

5.1.5样品的收集／运输装置

   样品的收集需采用一次性材料，样品的收集材料（如拭子、试纸）或试剂（如防腐荆、抗凝剂或其他常规添加剂）必须不会干扰扩增或检测过程，抗凝剂一般采用乙二胺四乙酸盐（EDTA）或枸橼酸盐，肝索对扩增反应有一定的抑制作用而且在以后的靶核酸提取中不易除去，应尽量避免使用l对游离的核酸，需灭活核酸酶使其稳定。

靶核酸（如DNA）应能从收集装置中释放出来，另外，收集、运输过程中某些介质可能会稀释样品，因此，必须考虑稀释对测定结果的影响。

5.1.6样品的核对

   收到样品后，应对病人姓名、样品类型、收集时间等进行详细核对。

5.2样品的运输

   样品收集后应尽快送至实验室进行检测，运输过程中，特别是在需要保持细胞的完整性时，应注意避免样品的过冷或过热，并尽量减少细菌等污染物的生长，而且必须保证样品巾的靶核酸免受内源性或外源性核酸酶的破坏与降解；游离核酸需经稳定化处理，靶核酸为RNA时要求更为严格（如对靶核酸为RNA的样品可加入异硫氰酸胍盐灭活其中的核酸酶），不同的实验对运输方法都有其特殊要求，应明确加以规定。

5.3样品的处理

   样品中的许多杂质能抑制TaqDNA聚合酶的活性，从而干扰扩增反应，样品的处理可去除这些干扰杂质，增加PCR扩增的成功率和可重复性，有利于检测的标准化，纯化样品中的核酸（DNA或RNA），可使待测核酸暴露，有利于与引物的退火。

5.3.1靶核酸的释放

   待扩增的靶核酸可能来源于不同的临床样品，如血液、体液、尿液、粪便、游离的细胞或组织块等。

靶核酸可有不同的存在形式和存在部位。

如病原微生物的靶核酸可存在于宿主细胞内与宿主DNA整合在一起、游离子宿主细胞核中或以各种形式存在于宿主细胞质中。

而且，临床样品中常含有蛋白、脂类等干扰物质，因此，在进行PCR扩增前，必须对样品进行预处理，实验中应根据靶核酸不同的存在状态，采取相应的处理方法。

承3.2靶核酸的分离

   经典的核酸提取方法包括去垢剂裂解、蛋白酶处理、有机溶剂提取及醇类沉淀等步骤，利用玻璃粉、二氧化硅及硅藻等具有吸附核酸特性的固体颗粒建立的核酸提取方法可以简单、快速、高效地提取适合于PCR扩增的靶核酸，目前已有许多商品化的核酸分离试剂盒可供选择。

5.3.3靶核酸的质量

   用于扩增的靶核酸序列必须是完整的，将制备的样品与标准品通过凝胶电泳进行比较即可初步判断靶核酸的完整性和含量，也可通过测定260nm和280nm波长下的吸光度确定提取的靶核酸的浓度和纯度。

5.3.4处理过程的复杂性

   样品的处理应尽量简化，以减少样品的交叉污染或丢失靶核酸的机会。

5.3.5样品的生物安全性

   样品中可能含有对人体有害的生物因子，处理过程中应注意防止其危害操作人员f对临床样品的处理，可参照实验室对临床样品的常规处理方法进行。

5.4样品的存放

   临床用于PCR测定的DNA靶核酸样品应在一定的缓冲液（如1×TE）中4℃保存lRNA靶核酸样品应在一定缓冲液中—80℃或液氮中存放。

用乙醇或异丙醇等沉淀的靶核酸样品存放在—20℃即可。

6污染的预防和控制

   由于PCR的扩增高效性和检测的高敏感性，极微量的污染即可导致假阳性结果，因此，必须特别注意避免样品DNA的污染所导致的假阳性结果。

PCR的污染途径主要有三个：

   a）来自其他待测样品DNA的交叉污染；

   b）来自其他实验材料如克隆质粒或菌体DNA的污染；

   c）来自同一靶序列上次PCR扩增产物的污染。

   其中由同一靶序列上次PCR扩增产物所引起的污染（遗留污染）最为常见，必须制定严格的实验室标准操作规程（standardoperationprocedure，SOP）以减少污染所致的假阳性结果。

6.1划分不同的操作区

   PCR的前处理和后处理应在不同的隔离工作台（生物安全柜）或房间内进行，整个操作流程要在不同的隔离区进行：

1）试剂准备和储存区；2）样品处理区；3）PCR扩增区；4）产物分析区。

虽然上述操作是分开的，但是还要注意仪器设备和耗材的专用及操作人员、物流的单方向流动。

如使用扩增反应和产物检测同时完成的荧光定量PCR方法或全自动PCR分析仪时，3）、4）两个区可以合并。

6.2分装试剂

   试剂的分装是预防、控制PCR污染的一项重要措施。

PCR所用的去离子水和缓冲液均应经过高压灭菌，由于引物和dNTP不能高压，一定要用高压过的去离子水进行配制，所有这些试剂均应在无待测样品和PCR扩增产物的试剂准备和储存区进行制备，分装贮存；同样，用于PCR检测的引物也应在以上环境中进行稀释、分装，每管标记批次。

6.3改进实验操作

   尽管上次PCR扩增产物的遗留污染是大多数假阳性反应的原因，但样品之间的交叉污染也是污染的原因之一。

因此，不仅要在进行扩增反应时谨慎操作，在样品处理的所有环节（从样品收集到靶核酸提取）都应注意，下面几点应格外引起重视：

   a）加样器最易受样品核酸或扩增产物气溶胶的污染，试剂准备、样品准备和扩增产物分析等各步骤中的加样器应严格分开使用；

   b）戴一次性手套进行操作，在进出不同的隔离区时都要换手套；

   c）避免反应液的飞溅，开盖时尤应注意，可予开盖前离心几秒钟使壁上和盖上的反应液集于管底，一旦飞溅，应立即更换手套；

   d）用一次性移液器或吸头进行操作，吸头不要暴露于空气，以预防扩增产物气溶胶的污染；

   e）在操作多份样品时，要制备反应混合液，先加可混合的组分（dNTP、缓冲液、引物和酶等），混合后再分装到不同的反应管，这样，可以减少操作，避免污染，增加反应的重复性；

   f）最后加入模板，加入后立即益紧反应管；

   g）用过的加样器吸头必须放人专门的消毒（如含次氯酸钠溶液）的容器内，实验桌椅表面每次工作后都应进行清洁，实验材料如出现外溅则必须作出记录。

6.4设立阳性与阴性对照

   选择阳性对照时，应选择特异性扩增条带较弱、重复性较好的样品；阴性对照应最后配制，这样，可以反映扩增反应的基本状况。

此外，每次扩增均应设立包括PCR体系各试剂的空白对照，空白对照中应含有除模板核酸外的所有组分。

6.5环境污染

   常见的污染源包括：

加样器、离心机、真空瓶、电泳装置、紫外灯箱、水浴锅、冰箱门把手、门把手和实验台面（生物安全柜）、空气气溶胶等，各区的工作台面工作前可先用0.5%次氯酸钠、再用70%乙醇擦拭。

6.6扩增产物的灭活及污染的处理

   尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）法；该法是在PCR反应中用脱氧尿嘧啶碱基（dU）置换脱氧胸腺嘧啶（dT），这样，扩增产物中含有几十或几百的dU，这种产物与UNG一起孵育后，因UNG可裂艇尿嘧啶碱基和戊糖磷酸骨架间的N。

糖苷键，可除去dU，产生数十或数百的无dU碱基位点，无dU的位点阻止TaqDNA聚合酶的链延伸作用，使其失去再扩增的能力，而且，这样的位点是热不稳定的，在热循环中会发生断裂，防止再次扩增的发生，PCR扩增产物越长，UNG抗污染的效率就越高。

UNG对不含dU的模板无任何影响，对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子也无任何作用。

   光化学灭活：

灭活PCR扩增产物另一个可选择的方法是应用可溶性的补骨脂素衍生物，这些化合物具有热稳定性，对引物退火和TaqDNA聚合酶的活性无影响。

扩增前，将补骨脂素衍生物加入到PCR反应混合液中，扩增后，在打开反应管盏之前，用长波紫外线照射，紫外线能穿透聚丙烯管。

激活补骨脂素衍生物，补骨脂素衍生物随后形成环丁烷，与扩增产物DNA上的嘧啶作用，形成带有嘧啶碱基的环戊烷，阻止TaqDNA聚合酶对这一分子的进一步扩增，其效率取决于扩增产物的长度和核苷酸的碱基组成，一般而言，产物长度超过300bp、碱基G+C含量大于50%时，本法几乎可灭活所有的扩增产物。

和酶法灭活不同，该方法不仅可灭活扩增产物，而且可灭活原始的靶核酸。

7质量控制

   进行PCR检测的实验室应经过检查并符合国家行政部门的相关认证要求，由经过培训的合格上岗人员进行操作。

有条件的实验窒还应积极参加各级质控机构和组织的室间质评活动，这样，有利于对不同实验室之间的检测结果进行同比分析。

7.1 扩增反应的质量控制

7.1.1 样品准备的质量控制

   设计一个样品处理方法最先应考虑的问题是：

能够最有效地分离出靶核酸并避免导入抑制因子和污染物，避免靶核酸被核酸酶降解并除去干扰检测的物质，设立这部分的对照必须能够反映以下问题，即，在样品中是否有靶核酸以及核酸的分离方式是否影响PCR反应。

当验证一个实验系统的样品处理方法时，需要用含靶核酸的整个有机体、以接近预期的检测极限浓度添加至阴性样品基质中，这样，所设立的对照可提供有关靶有机体溶解及靶核酸提取回收是否成功的有关信息，如果靶核酸存在于细胞内（如淋巴细胞），就应以整个细胞作为验证样品加入阴性基质中作为对照。

7.1.2设立外对照

 每次实验至少应设有弱阳性对照和一份阴性对照，以确定扩增的有效性。

7.1.3设立内对照

   利用内对照可验证每个单份样品中是否含有核酸，例如人类的HLA-DQAI、β-微球蛋白基因和其他一些保守序列，这些基因存在于样品的有核细胞中，可将其与靶核酸扩增体系一起扩增。

在设计扩增和检测基因突变时，可在突变区之外，同时扩增保守区序列作为对照。

7.1.4设立平行组

   两份病人样品，其中一份加入已知的核酸作为副本，加入量应临近可检测到的极限浓度，如果正本PCR结果为阴性，而副本为阳性，则可确定其阴性结果是真实的。

7.1.5样品的稀释

   对制备的样品进行几个稀释度的稀释，来检测抑制因子的存在，当样品稀释后，检测到的信号持续变强，说明有抑制因子存在，只要样品中存在有抑制因子，就应考虑进行样品稀释。

但样品稀释后靶核酸也被同时稀释，因此，必须注意确保稀释过程中靶核酸仍保持在具有临床检测意义的范围之内。

7.2抑制因子和干扰物的质控

   在临床样品中有多种成分通过与PCR反应组分发生作用，从而抑制PCR扩增反应。

已知血红素及其代谢物可抑制DNA聚合酶的活性，脑脊液、尿液中也含有成分尚未确定的DNA聚合酶的抑制因子，痰液中的酸性多糖、糖蛋白组分是聚合酶的抑制因子；临床样品中含有的核酸酶，会降解靶核酸。

另外，许多分子生物学研究巾常用的试剂，如乙二胺四乙酸、去污剂（如十二烷磺酸钠）、破膜荆（如盐酸胍）等对DNA聚合酶的活性也有一定抑制作用，从而导致假阴性结果。

   扩增反应的抑制因子可通过应用对照模板来进行检测，必要时，这种对照模板可在样品准备过程中加入（如内对照），因此也可作为靶核酸提取过程的对照（见7.1.3）。

设立内对照来监测是否存在抑制反应应根据实际需要而定，因为建立和应用这些内对照有相当的技术难度，并且可能会影响到整个实验。

7.2.1同源内对照

   同源内对照基因与扩增的目的靶基因有相似的序列，它们通过分子大小的差别或内部序列的不同相互区别。

同源内对照可以与目的靶基因二起应用相同的引物进行扩增，对照模板先加入到反应混合液中，每个反应提供10到1000个拷贝，用同源引物进行扩增。

但必须注意保证同源内对照的存在不能降低扩增体系的敏感性，假如一起扩增的内对照模板量太多的话，往往会降低目的基因扩增的敏感性。

含抑制物的样品，如不支持对内对照的扩增，那么很可能也不会支持对靶核酸序列的扩增，样品就应被视为不适于进行PCR扩增，或需要进一步处理以减少或清除抑制因子。

通常简单地将样品稀释就会降低，抑制因子的影响，此时要注意样品不能过度稀释，以致靶核酸被稀释到检测限度之下。

7.2.2异源内对照

   异源内对照不包含靶序列，需要用另一组独立的引物来扩增对照基因。

异源内对照通常采用人类HLA-DQAI和人类β-微球蛋白位点基因，任意靶核酸一般都可满足需要。

对照组扩增产物的分子量应与目的靶基因大小相同或更大，以保证更小分子量的任何产物都能被成功扩增。

7.3仪器的质量控制

   所有的仪器设备都必须保持清洁并进行定期维护，所有的水浴装置、培养箱都应贴有适当温度范围的质量控制表，记录每天的温度。

在实验室的质量保证（QualityAssurance，QA）手册中应有仪器校对的操作方法。

 a）加样枪，加样枪必须保证每年校正两次，校正方法可参考生产厂商推荐的方法或采取吸样称重法；

   b）水浴箱：

实验前用温度计进行校准；

   c）离心机：

离心机的速度每年应检查两次，离心机可能是污染的重要来源，应注意采取必要的预防措施；

   d）酶标仪：

每年进行两次校准；

   e）热循环仪：

目前各实验室使用的热循环仪有许多不同的种类和型号，可根据生产厂商推荐的方法进行校正，一年内至少对仪器校正两次I除仪器的自检功能外，应进一步进行循环参数的校正和功能性扩增实验，对不同部位的加热孔应保证其温度的均一性。

7.4校正测试