水飞蓟素总结报告.docx
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水飞蓟素总结报告
江苏省科技计划项目
验收报告
项目名称:
水溶性水飞蓟素提取加工技术研究及产品开发项目编号:
BE2006321
项目负责人:
何尔群
承担单位:
江苏健佳药业有限公司
起止年限:
2006年1月~2008年12月
一、原计划合同内容
二、项目实施工作总结报告(包括技术总结)
1.水溶性水飞蓟素提取工艺研究
2.水溶性水飞蓟素提取与加工技术路线
3.水溶性水飞蓟素化学成分的分析
4.水溶性水飞蓟素产品质量标准的研究与制定
三、技术成果
1.研究论文发表情况
2.专利申请情况
3.技术特点
四、经费使用情况
五、附件
一、原计划合同内容
1、主要研究内容
本项目是从水飞蓟籽中提取水溶性水飞蓟素。
通过对原料的预处理、水溶性水飞蓟素的提取、包合技术、澄清、分离、浓缩、干燥等过程的研究与改进,确定水溶性水飞蓟素的提取工艺条件,明确该产品的含量指标及一般理化指标,并完成中试,使水溶性水飞蓟素产品达到工业化生产水平。
制定水溶性水飞蓟素的质量标准,填补国内这一领域的空白。
2、主要技术指标
(1)确定水溶性水飞蓟素提取工艺条件,完成中试,达到工业化生产水平;
(2)制定水溶性水飞蓟素的质量标准;
(3)发表论文2~3篇。
3、参加人员
项目承担单位:
江苏健佳药业有限公司
项目参加单位:
江苏省中科院植物研究所
项目负责人:
何尔群
姓名
性别
年龄
职称/职务
从事专业
为本项目工作时间(%)
所在单位
何尔群
男
56
高级工程师
药学
80
江苏健佳药业有限公司
李维林
男
40
研究员
药学
30
江苏省中科院植物研究所
主要研究人员
周志清
男
51
经济师
经济管理
30
江苏健佳药业有限公司
徐伯衡
男
42
高级工程师
药化
60
江苏健佳药业有限公司
吴振祥
男
54
主任药师
药化
60
江苏健佳药业有限公司
任冰如
女
42
研究员
植物化学
40
江苏省中国科学院植物研究所
梁呈元
男
34
助理研究员
植物资源
60
江苏省中国科学院植物研究所
4、经费预算
1).经费来源预算
单位:
万元
合计
2006年
2007年
2008年
备注
合计
200
90
60
50
1、省拨款
25
25
2、部门、地方配套
3、承担单位自筹
175
65
60
50
4、银行贷款
5、其他来源
2).项目经费支出预算
单位:
万元
预算数
占预算支出总额的比重(%)
备注
合计
200
1、人员费
3
1.5
2、设备费
90
45
3、能源材料费
88
44
4、试验外协费
5
2.5
5、差旅费
2
1
6、会议费
2
1
7、管理费
5
2.5
8、基建费
2.0
2.0
9、其他相关费用
10、测试及试验费
5
2.5
二、项目工作总结(包括技术总结)
1、水溶性水飞蓟素提取工艺研究
(1)原料的预处理
水飞蓟种子榨油。
水飞蓟油可以制作色拉油具有色清、味纯、沸点低、易被人体吸收等特点,有保肝养胃功能,无任何毒副作用,是一种高级保健食用油。
榨油后的水飞蓟饼用于提取水溶性水飞蓟素。
提取水溶性水飞蓟素后渣饼富含淀粉、蛋白质,因不含任何有机溶剂,经适当加工后即能形成营养成份较高的天然饲料,是养禽、养猪、喂养水产品的极佳饲料。
(2)水溶性水飞蓟素的提取
采用碱水的醇溶液为溶剂,以水溶性水飞蓟素的得率和水飞蓟宾含量为工艺考察指标,以提取时间、提取温度、溶剂用量、pH值为实验因子,通过单因素试验和正交试验,研究并优选出了水溶性水飞蓟素的最佳提取工艺条件。
材料与仪器
水飞蓟种子采自于江苏东台本公司种植基地,由江苏省中国科学院植物研究所李维林研究员鉴定为菊科植物水飞蓟(紫花)(Silybummarianum(L.)Gaertn)的种子。
MettlerAE240电子天平,KQ-100DE型数控超声仪(昆山市超声仪器有限公司),北京普析通用TU-1901紫外-可见分光光度计,Shimadzu高效液相色谱仪(LC-20A泵,SPD-20A紫外检测器)等。
水飞蓟宾标准品(含量>99.5%,HPLC纯,中国药品生物制品检定所),其余试剂均为分析纯。
方法与结果
水溶性水飞蓟素提取工艺的单因素试验
1).pH值对水溶性水飞蓟素得率和水飞蓟宾含量的影响
分别称取水飞蓟饼500g,分别加入不同pH值的30%的碱乙醇1500ml,于80℃提取3遍,合并滤液,浓缩成到流膏,体积在500ml时,加入40g101澄清剂,搅匀,静置1h后,分离上清液,浓缩真空干燥,得粗品,再加入20倍体积纯化水,充分溶解,离心分离上清液,真空浓缩得成品。
称取成品重量,计算得率。
另取成品50mg,精密称定,置100ml量瓶中,加甲醇适量,水浴加热使溶解,冷却至室温,加甲醇稀释至刻度,摇匀,精密量取对照品溶液和供试品溶液各5ml,分别置25ml量瓶中,分别精密加2,4-二硝基苯肼溶液(取2,4-二硝基苯肼0.5g,置50ml量瓶中,加硫酸1ml使溶解,加甲醇稀释至刻度,摇匀)2ml,置50-55℃水浴中反应50分钟,冷却,加氢氧化钾-甲醇溶液(取氢氧化钾10g,置100ml量瓶中,加水30ml使溶解,加甲醇稀释至刻度,摇匀)稀释至刻度,摇匀,离心10分钟,精密量取上清液5ml,置25ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,照分光光度法(中国药典2005年版地附录ⅣA),在490nm的波长处分别测定吸收度,计算,即得水飞蓟素含量。
另取本品0.11g,精密称定,置50ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取5ml,置50ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液;另精密称取经60℃减压干燥3小时的水飞蓟宾对照品适量,加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.1mg的溶液,作为对照品溶液。
精密吸取上述两种溶液各5µl,分别注入液相色谱仪,记录色谱图,按外标法以水飞蓟宾与异水飞蓟峰面积之和计算。
试验结果如下图所示。
由图可以看出,随着碱水pH值的下降,水飞蓟素和水飞蓟宾的含量明显上升,可能是由于pH太高会破坏黄酮母核,导致含量下降,故碱水提取的pH采用在8-8.5为宜。
2).提取温度对水溶性水飞蓟素得率和水飞蓟宾含量的影响
分别称取水飞蓟饼500g,加入pH值为8的30%的碱乙醇1500ml,于90℃、80℃和70℃各提取3遍,合并滤液,浓缩成到流膏,体积在500ml时,加入40g101澄清剂,搅匀,静置1h后,分离上清液,浓缩真空干燥,得粗品,再加入20倍体积纯化水,充分溶解,离心分离上清液,真空浓缩得成品。
同1)法分别测定水溶性水飞蓟素得率和水飞蓟宾含量。
试验结果如下图所示。
由图中可以看出,随着温度的降低,水飞蓟素和水飞蓟宾含量在80℃达到最高,且此时水和乙醇的公沸点接近,故采用提取温度在80℃为宜。
提取水溶性水飞蓟素的正交试验
在前期经验的基础上,选择碱水的乙醇液为溶剂,以乙醇用量、乙醇浓度、提取时间为实验因素,每个因素设3个水平,进行L9(34)正交实验。
正交实验的因素和水平
水平
因素
溶剂用量(倍)A
乙醇浓度(%)B
提取时间(h)C
1
6+6+4
40
1.0+1.0+1.0
2
8+8+6
35
1.5+1.5+1.5
3
10+10+8
30
2.0+2.0+2.0
取榨油后的水飞蓟饼,分别精密称取9份,各500.00g。
按表选择的条件分别加入pH=8的碱水的乙醇液,于80℃提取3遍,合并滤液,浓缩成流膏,体积在500ml时,加入40g101澄清剂,搅匀,静置1h后,分离上清液,浓缩真空干燥,得粗品,再加入20倍体积纯化水,充分溶解,离心分离上清液,真空浓缩得成品。
加热回流提取,合并提取液,过滤,浓缩,回收乙醇,水浴(60℃)蒸至近干,再于真空干燥箱中(60℃)干燥,干燥器中冷却0.5h后迅速称重,粉碎成粉末。
水飞蓟宾的含量测定方法(HPLC法)及水飞蓟素的含量测定方法(UV法)同上1)法。
对照品溶液的配制和标准曲线的建立
精密称取水飞蓟宾标准品适量,以甲醇溶解并配制成含水飞蓟宾浓度为0.216mg·ml-1的溶液。
取对照品溶液10,12,14,16,18,20μl,分别进样,按上述色谱条件测定峰面积积分值,以峰面积积分值为纵坐标,对照品进样量为横坐标绘制标准曲线,计算回归方程。
Y=4.30664×105X+2.9658×104,r=0.9999。
结果表明水飞蓟宾在2.16~4.32μg内线性关系良好。
数据处理及结果
对正交实验结果采用综合评价方法,即以水飞蓟宾的含量加权系数0.6、水溶性水飞蓟素成品得率加权系数0.4作为综合评价指标。
综合评价分值=水飞蓟宾含量×0.6+水飞蓟素×0.4,结果下表。
方差分析结果见表,表明乙醇浓度、提取时间对实验结果有显著影响,其中乙醇浓度(B)影响最大,其次是提取时间(C),溶剂用量(A)影响较小。
由表2直观分析综合评价R值,最佳提取工艺是A3B2C2,即30%乙醇提取三次,每次提取2h,前两次加8倍量乙醇,第三次加6倍量乙醇。
以最佳工艺进行验证实验,结果表明该工艺重复性和稳定性好,适于大生产。
正交实验结果
实验号
影响因素
水飞蓟宾(%)
水飞蓟素(%)
综合评价
A
B
C
D
1
1
1
1
1
9.21
19.6
13.366
2
1
2
2
2
8.89
21.7
14.014
3
1
3
3
3
9.45
20.8
13.990
4
2
1
2
3
10.23
22.6
15.178
5
2
2
3
1
10.34
23.8
15.724
6
2
3
1
2
11.28
25.2
16.848
7
3
1
3
2
10.67
24.3
16.122
8
3
2
1
3
12.09
25.9
17.614
9
3
3
2
1
11.76
25.6
17.296
K1
10.89510.78010.82911.047
K2
11.98711.37210.19011.043
K3
11.19412.92411.05410.984
R
0.2990.5920.3620.063
方差分析
方差来源
SS
f
S
F
P
溶剂用量A
0.140454
2
0.07023
17.7008
>0.05
乙醇浓度B
0.571414
2
0.28571
72.0128
<0.05
提取时间C
0.20078
2
0.10039
25.3035
<0.05
误差项D
0.007935
2
0.00397
故最终确定水溶性水飞蓟素的最佳提取条件为:
提取时间为2小时,提取3遍,温度控制在80℃,溶剂量为物料8倍,pH为8-8.5,如pH太高,会破坏黄酮母核,含量会下降,太低又会影响产品收率。
(3)包合技术:
由于碱水提取时,总含量均大于40%,但由于不断去杂,精制时,黄酮损失很大,所以在提取完成后加入按成品量1倍的包合剂,将有效成分进行包合,确保有效成分不损失且水溶性又好。
(4)澄清:
以加入澄清剂后所产生的絮状物的重量为指标,通过试验确定澄清剂的加量为提取溶媒的1%,澄清条件为pH=8-8.5。
(5)分离:
根据水溶性水飞蓟素的特点,首先采用高速旋转分离,转速16000转/分钟,进料速度800L/h,直接去除大颗粒杂质,接着采用0.22μm微孔膜,进一步膜滤,使滤液出来完全达到注射级标准。
(6)浓缩:
由于水溶性水飞蓟素不宜在高温环境下长时间受热,我们采用了旋转刮板浓缩,使得物料在整个过程中始终处于一个动态作用下,不易结垢,不易炭化。
通过试验确定浓缩的条件为温度60℃,蒸汽压力<0.1MPa,真空度>-0.08MPa。
(7)干燥:
在试制过程中,采用喷雾干燥,使水溶性水飞蓟素瞬间受热,这样既不破坏有效成分又使物料不炭化,确保产品在水中有极好的溶解性。
通过多次试验,确定干燥的条件为进口温度140℃,出风温度80℃,进料速度150L/h。
2、水溶性水飞蓟素提取与加工技术路线
综合以上研究结果,制定水溶性水飞蓟素提取与加工的工艺技术路线如下:
水飞蓟种子
↓
榨油→水飞蓟油
↓
水飞蓟饼
↓
加工饲料←水飞蓟饼←—提取←—碱水←—纯化水
↓
浓缩
↓
去杂←—101澄清剂
↓
调节PH值
↓
上清液
↓
浓缩
↓
醇沉←—80%乙醇
↓
上清液
↓
浓缩、回收乙醇
↓
干燥
↓
重溶←—纯化水
↓
分离
↓
浓缩
↓
真空干燥、粉碎
↓
水溶性水飞蓟素成品
本工艺的关键技术如下:
(1)用碱水提取水溶性水飞蓟素时,碱水的浓度对提取过程有很大的影响。
若碱液浓度过高,在提取加热时会破坏黄酮。
而在加酸酸化时,酸性也不宜过强。
若酸性过强,会使析出的黄酮类化合物又重新溶解,降低产品收率。
(2)工厂化生产采用多功能提取罐生产,而水飞蓟饼一旦遇到水即会形成浆糊状,从底部很难出液,从而形成出液效率低,产品收率低及诸多不利因素。
现有的提取罐不适合水溶性水飞蓟素的提取。
本项目将对提取罐底部进行改造,设计出一种专用提取罐用于水溶性水飞蓟素的工业化提取。
(3)澄清剂的选择及其用量对产品中有效成分的含量及澄清度有很大影响。
澄清剂选择不当,会影响水溶性水飞蓟素的得率及其纯度。
3、水溶性水飞蓟素化学成分的分析
(1)水飞蓟宾的分离与纯化
仪器与材料
柱层析用硅胶(青岛海洋化工厂产品);BuchiRⅡ旋转蒸发仪。
实验方法
柱层析分离洗脱剂的选择
取5mg水溶性水飞蓟素溶于少量乙醇,硅胶板点样,分别用乙酸乙酯、氯仿:
甲醇(20:
1)、氯仿:
甲醇(10:
1)、氯仿:
乙醇(9:
1)、乙酸乙酯:
石油醚(1:
1)为展开剂,碘蒸汽显色,做薄层检验。
通过薄层层析分析,选择乙酸乙酯或氯仿:
甲醇(20:
1)作洗脱剂。
柱层析分离水飞蓟宾
用硅胶填充柱:
将100-200目柱色谱硅胶用乙酸乙酯(或氯仿:
甲醇=20:
1)搅拌均匀,将玻璃柱均分为6等分,灌入约4/6柱高的硅胶,下口用脱脂棉塞住。
拌水溶性水飞蓟素硅胶粉:
将30g水溶性水飞蓟素溶于乙酸乙酯(或甲醇)中,滤去不溶解的杂质,向滤液中加入约等于1/6柱的硅胶,充分拌匀。
使溶剂挥干,装入柱中,上面用脱脂棉塞住。
浇柱:
用洗脱剂浇柱,用锥形瓶接收淋洗液,直至淋洗液无色透明为止。
浓缩:
淋洗液经旋转蒸发浓缩后,用薄层色谱检测单斑的为纯品水飞蓟宾,将接收瓶中含纯品的液体合并,回收溶剂,浓缩干燥得白色晶体即为纯品水飞蓟宾。
结果与分析
经薄层色谱检验,观察了硅胶板上各点的高度,比较不同的展开剂的Rf值,并与标准品对照。
通过比较选用乙酸乙酯或氯仿:
甲醇(20:
1)作洗脱剂进行试验。
结果用乙酸乙酯作洗脱剂由于溶剂极性很大,其流出速度太快,效果不是很理想。
n(氯仿):
n(甲醇)=20:
1效果比较理想,因此选用n(氯仿):
n(甲醇)=20:
1作洗脱剂。
(2)水飞蓟宾的鉴定
状态:
白色晶体,熔点:
164.5-165.6℃(显微熔点测定仪),与标准品对照一致。
HCl-Mg粉试验:
玫瑰红色;与NaOH溶液反应:
深黄色;与浓H2SO4反应:
黄色。
UV:
λmax(MeOH)=288nm,λ=330nm处有肩峰,与文献谱图一致。
薄层色谱检验:
用色谱用硅胶板(青岛海洋化工厂产品),其Rf=0.44(氯仿:
乙醇=9:
l展开剂,碘蒸气显色)。
IR:
3150、1650、1520、1470、l380、1285、1200、1175、1135、1090、1045、1030、1005、965、830、800处有峰(cm-1)。
4、水溶性水飞蓟素产品质量标准的研究与制定
(1)水溶性水飞蓟素产品质量标准的研究
材料与仪器、试剂
水飞蓟宾标准品(含量>99.5%,HPLC纯,中国药品生物制品检定所);水溶性水飞蓟素产品由本公司自制,批号为20070921、20071108、20071209。
岛津LC-10A高效液相色谱仪;日本岛津SPD-10A检测器;浙江大学N2000色谱工作站;METTLERAE240电子天平。
甲醇为色谱纯,水为纯净水,其余试剂均为分析纯。
方法与结果
色谱条件
色谱柱AichromBond-C18(5μm,4.6×250mm);以甲醇-水-冰醋酸(50:
50:
0.5)为流动相,检测波长为288nm,理论板数按水飞蓟峰计算应不低于5000。
对照品溶液的制备
精密称取经60℃减压干燥3小时的水飞蓟宾对照品适量,加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.1mg水飞蓟宾的溶液,作为对照溶液。
供试品溶液的配制
取本品0.11g,精密称定,置50ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取5ml,置50ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液。
线性关系考察
取对照品溶液2、4、6、8、10μl,分别进样,按上述色谱条件测定峰面积积分值,以峰面积积分值为纵坐标,对照品进样量为横坐标绘制标准曲线,计算回归方程得水飞蓟宾:
Y=871.66X-0.4488,r=0.9999。
结果表明水飞蓟宾含量在0.020~0.100μg内线性关系良好。
精密度实验
取对照品溶液,在上述色谱条件下重复进样6次,每次5μL,水飞蓟宾的峰面积RSD为1.09%,说明该方法精密度良好。
重复性试验
取水溶性水飞蓟素产品(批号20070921)共6份,分别前述样品溶液制备方法和色谱条件操作,计算含量。
结果显示水飞蓟宾的平均含量为11.129%,RSD=1.1%,说明该方法有良好的重复性。
加样回收率测定
准确称取水溶性水飞蓟素产品(批号20070921,其中水飞蓟宾含量为11.129%)5份,每份10.0mg,分别精密加入水飞蓟宾对照品溶液25ml(浓度为0.010032mg·ml-1),精密加入甲醇至50ml,按前述样品溶液制备方法及色谱条件和测定方法,进行含量测定。
结果显示水飞蓟宾平均回收率为97.28%,RSD=1.0%,说明该法回收率良好。
样品分析
精密称取各批次样品各3份,按前述样品溶液制备方法及色谱条件和测定方法,测定水飞蓟素含量,用外标法,根据峰面积计算含量,结果其含量分别为11.364%,10.865%,11.250%。
结论与讨论
在本实验所确定的条件下,水溶性水飞蓟素产品中的主要成分水飞蓟宾能很好地分离,且重现性、精密度较好,可以作为水溶性水飞蓟素的质量控制方法。
(2)水溶性水飞蓟素产品质量标准的制定
根据以上研究结果,制定水溶性水飞蓟素产品质量标准如下:
水溶性水飞蓟素质量标准
本品为菊科植物水飞蓟(SilybumMarianum(L.)Gaertn)的果实,经提取所得的松散粉末,按干燥品计含水飞蓟素以水飞蓟宾计算(C25H22O10)不得少于25.0%,含水飞蓟宾和异水飞蓟宾不得少于10.0%。
[性状]本品为淡黄色至浅棕色的松散粉末,在水中溶解。
[鉴别]取本品0.1克,加甲醇10ml,振摇,滤过,取滤液,照下述方法试验。
(1)取滤液1ml,加锌粉少许及盐酸数滴,即显玫瑰红色。
(2)取滤液2ml,加醋酸铅试液1ml,即产生黄色沉淀。
(3)取滤液适量,用甲醇稀释制成每1ml中约含16ug的溶液,照分光光度法(中国药典2005年版二部附录ⅣA)测定,在288nm的波长处有最大吸收。
[检查]溶解性取本品1克,加纯化水200ml振摇溶解,应澄清。
干燥失重 取本品,在70℃减压干燥3小时,减失的重量不得超过5.0%(中国药典2005年版二部附录Ⅷ L)
炽灼残渣 不得过0.5%(中国药典2005年版二部附录ⅧN)
重金属 取炽灼残渣项下遗留的残渣,依法检查(中国药典2005年版二部附录ⅧH第二法),含重金属不得过20ppm。
[含量测定]水飞蓟素(总黄酮)对照品溶液的制备 取水飞蓟宾对照品约10mg,精密称定,置25ml量瓶中,加甲醇适量,水浴加热使溶解,冷却至室温,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。
供试品溶液的制备 取本品50mg,精密称定,置100ml量瓶中,加甲醇适量,水浴加热使溶解,冷却至室温,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。
测定法 精密量取对照品溶液和供试品溶液各5ml,分别置25ml量瓶中,分别精密加2,4-二硝基苯肼溶液(取2,4-二硝基苯肼0.5g,置50ml量瓶中,加硫酸1ml使溶解,加甲醇稀释至刻度,摇匀)2ml,置50-55℃水浴中反应50分钟,冷却,加氢氧化钾-甲醇溶液(取氢氧化钾10g,置100ml量瓶中,加水30ml使溶解,加甲醇稀释至刻度,摇匀)稀释至刻度,摇匀,离心10分钟,精密量取上清液5ml,置25ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,照分光光度法(中国药典2005年版地附录ⅣA),在490nm的波长处分别测定吸收度,计算,即得。
水飞蓟宾照高效液相色谱法(<<中国药典>>2005年版二部附录VD)测定。
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇-水-冰醋酸(50:
50:
0.5)为流动相,检测波长为288nm,理论板数按水飞蓟峰计算应不低于5000。
测定法取本品0.11g,精密称定,置50ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取5ml,置50ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液;另精密称取经60℃减压干燥3小时的水飞蓟宾对照品适量,加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.1mg水飞蓟宾的溶液,作为对照品溶液。
精密吸取上述两种溶液各5µl,分别注入液相色谱仪,记录色谱图,按外标法以水飞蓟宾与异水飞蓟宾峰面积之和计算。
[类别]肝病辅助用药。
[贮藏]遮光,密闭,在阴凉处保存。
[制剂]针剂,冲剂。
[有效期]2年。
三、技术成果
1、研究论文发表情况
(1)Yong-pingPei,JianChen,Wei-linLi,etal.ProgressinResearchandApplicationofSilymarin.MedicinalandAromaticPlantScienceandBiotechnology,inpress
(2)陈剑,李维林,任冰如等.水溶性水飞蓟素提取工艺的改进与探讨.植物资源与环境学报,已接收
2、专利申请情况
专利申请号200710106033.4
3、技术特点
(1)目前国内普遍的水溶性水飞蓟素提取方法是加入葡甲胺,让水飞蓟素和葡甲胺进行化学合成所得,产品虽然溶于水,但副作用较大,对人体肾功能有阻碍作用,在国际上不能被客户接受。
本项目研究利用了黄酮类物质在碱水中溶解的特性,再在无有机溶剂的条件下及时