中药药理中药免疫研究和中兽药研发工作 当归不同药用部位水提液体外清除自由基作用研究.docx

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中药药理中药免疫研究和中兽药研发工作当归不同药用部位水提液体外清除自由基作用研究

中药药理、中药免疫研究和中兽药研发工作.当归不同药用部位水提液体外清除自由基作用研究

（作者:

___________单位:

___________邮编:

___________）

作者：

华永丽，郭延生，邓红娟，程越山，曲亚玲，魏彦明【摘要】目的研究生当归、当归头、当归身、当归尾的水提取液体外对羟自由基（·OH）和氧自由基（O2-·）的清除作用。

方法应用分光光度法测定不同当归水提液对Fenton反应产生的羟自由基（·OH）和邻苯三酚自氧化产生的氧自由基（O2-·）的清除能力。

结果当归不同部位水提液在受试浓度范围内对羟自由基和氧自由基有明显的抑制作用，随当归及其不同部位水提液浓度的增加，抑制率明显升高，呈明显的量效关系，对羟自由基的清除能力依次为生当归当归身≈当归头当归尾，对氧自由基的清除能力依次为当归身≈生当归当归头当归尾。

结论当归不同部位水提液体外均具有较好的清除自由基的作用，不同药用部位在清除氧自由基和羟自由基能力上表现不同。

【关键词】当归;不同部位;水提液;羟自由基;氧自由基　　Abstract：

ObjectiveTostudytheeffectofwaterextractsofdifferentpartsofRadixAngelicaeSinensisonhydroxylradicalsandoxygenfreeradicals.MethodsTheinhibitionrateofwaterextractsofdifferentprocessedproductsofRadixAngelicaeSinensisonfreeradicalinvitroweredetectedbyspectrophotometry.ResultsTheresultsshowedthatwaterextractsfromdifferentpartsofRadixAngelicaeSinensisinvitrohadsignificantscavengingeffectsonhydroxylradical.Furthermore,theextractsexhibitedasignificantconcentration-dependentelimination.ConclusionThewaterextractsfromdifferentpartsofRadixAngelicaeSinensishavesignificantantioxidativeactionsinvitro.ThereexistsignificantdifferencesamongthesedifferentpartsofRadixAngelicaeSinensisonscavenginghydroxylradicalandoxygenfreeradical.　　Keywords：

RadixAngelicaeSinensis;Differentparts;Waterextracts;Hydroxylradicals;Oxygenfreeradical　　当归为伞形科当归属植物当归Angelicasinesis（Oliv.）Diels.的干燥根，主产于甘肃岷县等地，属甘肃道地药材，是中（兽）医临床常用药，性温，味甘、辛，具有补血活血、调经止痛、润燥滑肠等功效[1]。

中医药传统理论和临床经验认为，当归不同药用部位具有不同的药效。

现代药理研究表明，当归在心血管系统、血液系统、免疫系统、抗损伤及保护方面均显示良好的药理作用，且具有一定的抗氧化和清除自由基的作用，对脑缺氧、缺血后再灌注脑组织脂质过氧化增高具有明显的抑制作用[2]，而中药抗氧化的作用机制是清除机体在正常细胞代谢中产生的超氧阴离子自由基、羟自由基、过氧化氢、单线态氧等自由基[3]。

为此,本实验分别以超氧阴离子和羟自由基为检测指标，研究当归不同药用部位抗氧化作用的异同，以期从生物学角度探讨当归不同药用部位入药的依据。

　　1材料与仪器　　1.1药物和试剂生当归采于甘肃岷县（经甘肃中医学院中药学系龙全江副教授和甘肃农业大学动物医学院中兽医教研组鉴定为伞形科当归属植物当归），取原药材，除去杂质，洗净，润透，分头、身、尾切成薄片，晒干或低温干燥。

无水乙醇、FeSO4·7H2O、水杨酸、H2O2、邻苯三酚、盐酸、L-抗坏血酸等均为分析纯;三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）为进口上海中秦化学试剂有限公司分装。

　　1.2仪器RE-6000旋转蒸发仪（上海亚荣），TBZ5-WS多管架自动平衡离心机（湘仪），HH-501超级恒温水浴箱，OPPON-3000型紫外/可见光分光光度计（韩国），CW-2000型超声-微波协同萃取仪，AL104电子分析天平，SHB-III循环水式多用真空泵，C型玻璃仪器气流烘干器，XW-80型旋涡混合器等。

　　2方法　　2.1当归水提液制备分别取生当归、当归头、当归尾、当归身各100g，加蒸馏水300ml，85℃超声-微波协同提取2次，每次30min。

合并两次提取液，减压浓缩至质量浓度1g/ml。

4℃保存备用。

　　2.2羟自由基体系参照Fenton反应的方法建立反应体系模型[4,5]，采用固定反应时间法[6,7]，在相同体积的反应体系（6mmol/L的H2O21ml，6mmol/L的Fe2+1ml，6mmol/L的水杨酸-乙醇溶液1ml）分别加入不同浓度的生当归、当归头、当归尾和当归身水提液1ml，设置5个浓度组（质量浓度分别为5，10，20，40，80mg/ml），每个浓度设10个平行管。

以蒸馏水为参比，在510nm处测量各浓度下的吸光度，通过公式计算其清除率。

以L-抗坏血酸为阳性药物对照，质量浓度分别为0.15，0.20，0.25，0.30，0.35mg/ml共5个浓度组，每个浓度设10个平行管。

　　公式：

清除率（%）=[Ai-（Aj-Ad）]/Ai×100%　　Ai为空白对照液的吸光度;Aj为加入药物溶液后的吸光度;Ad为不加显色剂H2O2药物溶液本底的吸光度。

　　2.3氧自由基体系[8,9]采用邻苯三酚自氧化法[10～12]：

邻苯三酚在弱碱性介质中自氧化分解产生O2-·，利用O2-·清除剂能使邻苯三酚自氧化产物在325nm处的吸收峰受到抑制这一特点设计实验，实验分为对照管和加药管，对照组管设5个平行管，分别加入50mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液（pH8.2，含1mmol/L二乙基三氨基五乙酸）4.5ml，加入4.2ml双蒸水，混匀后25℃水浴保温20min，取出后立即加入25℃水浴中预热的6mmol/L的邻苯三酚0.3ml（以10mmol/LHCl代替邻苯三酚作为空白），混匀后立即倒入比色杯，于325nm处每隔30s测A值1次，共测5min，计算对照管溶液吸光度随时间的变化率。

加药组设5个平行管，在加入邻苯三酚前先加入1.0ml当归提取液（设质量浓度分别为25，50，100，200mg/ml共4个浓度梯度），再加入3.2ml双蒸水，混匀后25℃水浴保温20min，取出后立即加入在25℃水浴中预热的6mmol/L邻苯三酚0.3ml，混匀后立即倒入比色杯，于325nm处每隔30s测A值1次，共测5min，计算当归及其炮制品水提取液吸光度随时间的变化率。

以空白管标零。

以L-抗坏血酸为阳性药物对照，设质量浓度分别为0.02，0.04，0.08，0.16mg/ml共4个浓度组，每个浓度设5个平行管。

　　公式：

清除率（%）=（⊿A-⊿A0）/⊿A×100%　　⊿A：

表示对照管邻苯三酚自氧化变化速率;⊿A0：

表示加药管邻苯三酚自氧化变化速率）便能测定被测物对O2-·的清除作用。

　　2.4数据统计处理用SPSS13.0统计软件进行方差分析、回归分析和线性相关，测定结果以±s表示，以（P0.05）为检验水准。

　　3结果　　3.1当归不同药用部位水提液对羟自由基的清除作用由表1可以看出当归不同部位水提液在不同实验浓度范围内都表现出不同的对羟自由基清除能力（P0.05），随着不同当归水提液浓度的增加，抑制率明显增加，表明均呈明显的量效关系（r值分别为生当归0.971、当归头0.960、当归身0.946、当归尾0.961，P0.05）。

由表3可以看出不同药用部位IC50从小到大依次为生当归、当归身、当归头、当归尾，即生当归水提物对羟自由基的清除能力依次为生当归当归身≈当归头当归尾。

表1当归不同部位水提液对羟自由基的清除作用　　3.2当归不同药用部位水提液对氧自由基的清除作用由表2可以看出当归不同部位水提液在不同实验浓度范围内都表现出不同的对氧自由基清除能力（P0.05），随着不同当归水提液浓度的增加，抑制率明显增加，表明均呈明显的量效关系（r值分别为生当归0.983、当归头0.946、当归身0.915、当归尾0.926、，P0.05）。

由表3可以看出不同药用部位IC50从小到大依次为当归身、生当归、当归头和当归尾，即生当归及其炮制品水提物对氧自由基的清除能力依次为当归身≈生当归当归头当归尾。

　　4讨论　　体外实验结果表明，生当归、当归头、当归尾、当归身水提取物能清除反应体系产生的O2-·和Fenton系统产生的·OH，均具有良好的量效关系，其均具有一定的抗氧化作用。

当归不同药用部位抗氧化作用存在一定差异性，清除羟自由基能力为生当归当归身≈当归头当归尾。

清除氧自由基的能力为当归身≈生当归当归头当归尾。

不同药用部位在清除氧自由基和羟自由基能力上表现不同　表2当归不同部位水提液对氧自由基清除作用　表3当归不同药用部位水提液对氧自由基羟自由基半数抑制率　　L-抗坏血酸氧自由基12.9913.7113.4317.000.18羟自由基63.3284.1661.496.230.104　　据文献报道，当归中的化学成分为苯酞类、香豆素类、黄酮类、挥发油类、有机酸类、多糖类化合物及其他成分。

在当归的这些化学成分中，除香柑内酯等呋喃香豆素外，其他类化学成分几乎都与抗氧化有关[13]，其中阿魏酸[14]、挥发油[13]和多糖[15]都被认为是抗氧化的主要成分作用，而这3类成分现在被普遍认为是当归的主要成分。

当归不同药用部位中，挥发油、阿魏酸含量以归尾最高，归头最低[16]，这个结果与实验所得当归头的清除氧自由基和羟自由基能力强于当归尾不一致，说明当归不同药用部位清除自由基的能力是多种化学成分协同作用的结果，也正是中药多成分、多靶点作用的结果。

当归不同药用部位提取物中含量及相互间的比例有所变化，这些成分之间协同作用，共同表现为清除氧自由基和羟自由基的不同能力，而究竟是如何协同作用，还有待进一步分析不同药用部位的化学成分变化。

　　中医药传统理论和临床经验认为，止血用当归头，补血用当归身，破血用当归尾，和血（即补血活血）用全当归。

本实验所得结果也表明当归不同药用部位清除氧自由基和羟自由基的能力不同，因此提示当归的分部位用药和炮制入药有一定的意义，为中医药传统理论的验证提供了佐证。

　　综上所述，不同药用部位之间在清除氧自由基和羟自由基能力上表现不同，这一实验结果与当归不同药用部位的化学成分变化进行分析，发现其抗氧化能力可能不是单一成分作用的结果，而是多个成分协同作用，提示中药的研究不能以单一成分为指标;而中药不同部位入药的每个细节都与临床息息相关，在评价当归不同药用部位作用时需要考虑的这一问题,需选择多种具有代表性的指标进行研究，以期获得较为科学地阐明其分部位用药原理及功效。

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