真菌学实验报告.docx

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真菌学实验报告

真菌学实验报告

一.实验目的：

1.1了解真菌形态的基本特征。

1.2掌握丝状真菌制片方法。

1.3掌握内生真菌的分离方法

1.4掌握真菌的鉴定方法。

二.前言：

真菌广泛分布于地球表面,从高山、湖泊到田野、森林，从海洋、高空到赤道、两极，到处都有真菌。

真菌虽然不在空气中生长繁殖，但它的孢子却成群的漂浮在天空，只要稍微注意你会发现人类原来生活在真菌的汪洋大海中。

当今世界，生物技术已迈入世界经济的支柱产业，真菌学在生物技术的大潮中得到了长足的发展。

真菌是原始的真核生物，具有广泛的多样性，真菌生长我繁殖迅速，在很短的时间内就可以得到比动物和植物多得多的后代，能够直接、快速地进行遗传性状分离的分析。

因此，真菌可以作为研究基础生物学过程中的一个重要工具，真菌基因的多样性以及真菌分子生物学的发展，为生物技术产业提供了一个广阔的天地。

植物的生长环境直接影响内生真菌的生物多样性，植物物种的年代越久远，其生物内生真菌的多样性越丰富：

抗病原性能越强的植物，其所含的内生真菌具有抗菌活性的可能行就越大；其所含的内生真菌有可能产生与植物相同或相似的抗菌无知或产生抗菌活性物质可能参与了药用植物的抗菌过程，本实验通过植物病原真菌和G+、G-细菌的抑制实验发现茎，根，花，种子或果实内生真菌的代谢产物具有不同程度的抑菌能力，并且对G+、G-有普片遍的抑菌作用。

研究和开发内生真菌的寻找新的抗菌活性物质具有广泛的应用前景。

三.材料与方法：

3.1.1材料：

在校园内采集银杏、喜树、桂花树样品包括叶、茎、根、花、种子或果实。

3.1.2.药品与试剂：

葡萄糖、蛋白胨、KH2P04·3H2O、MgSO4·7H2O，马铃薯、琼脂。

孟加拉红，青霉素，链霉素，甲基蓝，蛋白胨，酵母膏，蔗糖，磷酸盐，葡萄糖，琼脂条，无菌水等。

消毒剂：

75%的乙醇，0.1%升汞（HgCl2），次氯酸钠溶液（含活性氯10%），30%双氧水。

双蒸水、琼脂糖，Tris饱和酚、巯基乙醇（β-Mercaptoethanol），石英砂，Tris饱和酚，氯仿，异戊醇，无水乙醇，硼酸，冰醋酸，氯化钠，盐酸，氢氧化钠，EDTA，CTAB。

3.1.3.培养基：

3.1.3.1马铃薯、葡萄糖琼脂培养基

马铃薯汁1000ml，葡萄糖20g，琼脂20g

（注：

取去皮马铃薯200克，切成小块，加水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升，加葡萄糖20克，琼脂15克，溶化后分装，15磅灭菌30分钟

3.1.3.2察氏琼脂培养基

蔗糖30g，NaNO33g，MgSO4.7H2O0.5g，KCl0.5g，FeSO4.7H2O0.01g，K2HPO41g，琼脂13g，蒸馏水1000ml，自然pH

3.1.3.3沙氏培养基

蛋白胨1g，葡萄糖或麦芽糖4g，琼脂1.5克，水100ml。

制法：

1将上述物质称好，放入水中煮沸溶解（不必调PH即有5左右）分中号试管（约4毫升）包扎，高压115℃20分钟。

趁热斜好，凝固备用。

3.1.3.4马丁氏培养基

葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.5g，1%孟加拉红3.3mL，琼脂20g，水1000mL，pH值自然。

抗生素用法与用量：

培养基灭菌之后分装前按链霉素40U/mL，青霉素30U/mL用量加入，冷却到45℃左右未凝固时加入抗生素，混匀倒平板。

四.方法：

4.1.1采样方法：

在校园内找到银杏、喜树、桂花树并用刀采集叶、茎、根、皮、种子。

4.1.2样品前处理：

分别取根、茎、叶、果实，用洗涤剂在自来水下洗净。

老树皮用75%酒精进行表面消毒后，用镊子取出，于酒精灯上烧灼15秒至表面焦糊，切成1×1cm2大小置于PDA固体培养基上。

对于根、茎、叶、果实按下列程序进行表面消毒：

75%的酒精漂（浸）洗2-3min→无菌水冲洗4-6次→0.1%升汞不同的消毒时间（见表2-2，共设置7个梯度）→无菌水冲洗4-6次→用灭菌滤纸吸干多余水分→无菌刀片将材料切成小块将根、茎的表皮、韧皮部、木质部大致分开，并切成0.5×0.5cm2大小。

将果实的外种皮去掉，消毒之后将内种皮去掉。

灭菌时，沥干的植物材料转放到烧杯中，记好时间，倒入消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻底。

在快到时间之前1-2分钟，开始把消毒液倾入一备好的大烧杯内，要注意勿使材料倒出，倾净后立即倒入无菌水，轻搅漂洗。

灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止。

灭菌液要充分浸没材料。

宁可多用些灭菌液，切勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。

4.1.3内生菌的分离方法：

将上述组织块置于分离培养基上（每一平皿培养5块组织块）于27℃恒温培养，同时将上述消毒过程中最后一次冲洗组织块后的无菌水滴在培养基上平行培养，用以检测消毒是否彻底。

观察菌丝生长情况及污染情况。

4.1.4纯化方法：

培养3-4天后及时采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌丝或菌落移种到新鲜PDA培养基上。

纯化3-4次以保证所得菌落为纯培养。

4.2形态鉴定方法：

4.2.1培养方法：

4.2.1.1培养基：

查氏培养基、沙氏培养基和PDA培养基。

4.2.1.2将4℃保存菌种活化2次；

4.2.1.3将活化菌种分别点种PDA、沙氏、察氏平板，每重复

4.2.1.425℃恒温培养箱培养7天；

4.2.1.5然后进行菌落特征描述，取一个平行进行制片（胶带子粘片法），观察个体形态；

4.2.1.6另两个平行继续培养至14天，取出；

4.2.1.7重复步骤4，作为最终描述结果；

4.2.1.8根据真菌分类鉴定手册和相关资料分析确该菌的归属。

4.2.2制片方法：

胶带粘贴法：

选用在显微镜油镜下观察细致不粗糙且粘性好的胶带。

取一小段胶带从菌落表面的中心向边缘粘，75%乙醇固定，乳酸石炭酸棉蓝染色液染色，将粘有菌丝的一面向上，盖上盖玻片，于显微镜下观察产孢结构等特征。

4.2.3鉴定标准：

观察的要点：

4.2.4菌落宏观形态：

大小：

以菌落的直径（mm）表示。

颜色：

包括菌落表面和背面的颜色，及色素是否渗入培养基。

菌落表面的纹饰：

如皱纹、辐射沟纹、同心环、整个菌落致密或疏松等。

菌落的质地：

毡状、毯状、绒毛状、棉絮状、粉粒状、革质状、有无成束状或绳状的气生菌丝。

菌落的高度：

扁平、凸起或隆起，及菌落中心部分状况等。

菌落边缘：

全缘、锯齿状、树枝状等。

渗出物：

菌落表面有无液滴及液滴的颜色等。

4.2.5个体形态：

菌丝的特征：

表面性状（粗糙或光滑），宽度等

分生孢子梗：

分支情况--简单或复杂，轮生或单生等；长短；基部粗糙或光滑等。

产孢结构的形态特征：

形状，大小，着生状况（位置，单生、互生或成轮生体）

分生孢子的形态：

形状，大小，表面状况，聚集方式（直链、斜链或聚集成

头）

4.3分子生物学鉴定：

4.3.1培养方法：

培养基成分与不加琼脂的PDA固体培养基成分相同。

将液体培养基以100mL每瓶分装至250mL三角瓶中，用8层纱布封口。

121℃，蒸汽灭菌20min。

将菌丝致密的真菌接种到液体培养基中，于恒温振荡培养箱中27℃、120rpm培养5-7天。

用两层灭菌纱布过滤菌丝球，用无菌蒸馏水冲洗菌丝球5次，避免培养基中的糖类和蛋白对DNA提取的影响。

40℃下烘干菌丝，但是不要过于干燥，然后进行DNA的提取。

4.3.2基因组DNA的提取

DNA提取采用CTAB法。

CTAB（cetyltriethylammoniumbromide，十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度时，从溶液中沉淀，通过离心可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。

CTAB法的好处是能很好地去掉糖类杂质，提取前期可得到高含量的DNA。

4.3.2.1用CTAB法提取材料DNA的具体步骤如下：

将CTABbuffer在65℃水浴锅中预热，研钵用液氮预冷；

4.3.2.2取0.1g左右菌丝体，在液氮中迅速研磨成粉末后，迅速加入5mL预热的提取液及10μLβ-巯基乙醇，混合均匀后把混合液转入1.5mL离心管中700μL/管；

4.3.2.3于65℃水浴保温0.5-1h，时间不能超过1.5h。

保温期间要轻轻振摇几次；

4.3.2.4冷却至室温后，加入等体积（700μL）的饱和酚：

氯仿：

异戊醇（25：

24：

1），充分混匀后静置10min。

4.3.2.5离心（12000rpm，10min，室温），去沉淀，将上清液转入干净离心管中。

4.3.2.6根据杂质的去除情况重复步骤4、5数次，直至无杂质；

4.3.2.7加入等体积氯仿：

异戊醇（24：

1）抽提一次以去除饱和酚，离心（12000rpm，10min，室温）；

4.3.2.8将上清液逐滴加入两倍体积的-20℃预冷无水乙醇，以沉淀出DNA。

室温放置10-20min，可以过夜；

4.3.2.9挑取或离心去上清液（10000rpm，5min）的方法取出DNA；用75%乙醇洗涤两次；

<10>37℃保温箱中干燥后溶于适量的TE缓冲液中4℃备用。

4.4所用引物

ITS5：

GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG

ITS4：

TCCTCCGCTTATTGATATGC

4.4.1PCR反应条件：

4.4.1.1体系：

PCR反应体系为50μL体系，包括：

10×PCRbuffer：

1/10

MgCl2：

1.5mM，

dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）：

各200μM，

Primer10.2μM，

Primer20.2μM，

Taq酶：

1~2.5U，

DNA模板：

约100ng。

4.4.2条件：

扩增条件

预变性95℃5min

变性95℃1min

复性51℃1min30~35个循环

延伸72℃1min

延伸补齐72℃10min

4.4.3测序方法：

送测序公司。

4.4.4序例分析：

五．结果及分析：

结果：

试验分离到两种真菌

5.1八爪金盘分离到菌种查氏正反照

5.1.1菌落宏观形态：

大小：

菌落的直径3.2（mm）。

颜色：

包括菌落表面棕黑色背面灰色，色素渗入培养基。

菌落表面的纹饰：

如皱纹、整个菌落致密。

菌落的质地：

毡状

菌落的高度：

凸起或隆起。

菌落边缘：

锯齿状。

渗出物：

菌落表面无液滴。

5.1.2个体形态：

菌丝的特征：

表面粗糙。

分生孢子梗：

分支复杂，轮生。

5.1.3分子生物学鉴定

通过PCR扩增和序列分析，送公司检测得到的序列为：

TGAAGTTAAAAAGCGTAACAAGGTCTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACAAGTGACCCCGGTCTAACCACCGGGATGTTCATAACCCTTTGTTGTCCGACTCTGTTGCCTCCGGGGCGACCCTGCCTTCGGGCGGGGGCTCCGGGTGGACACTTCAAACTCTTGCGTAACTTTGCAGTCTGAGTAAACTTAATTAATAAATTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCACCACTCAAGCCTCGCTTGGTATTGGGCATCGCGGTCCGCCGCGTGCCTCAAATCGACCGGCTGGGTCTTCTGTCCCCTAAGCGTTGTGGAAACTATTCGCTAAAGGGTGTTCGGGAGGCTACGCCGTAAAACAACCCCATTTCTAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAATCGGAGGAA

通过blast序列分析得到的结果为：

Distributionof100BlastHitsontheQuerySequence

Sequencesproducingsignificantalignments：

5.2桂花树茎分离到PDA正反照

镜检：

5.2.1菌落形态：

大小：

菌落的直径22mm。

颜色：

菌落表面的颜色为棕黄色背面为黄色。

菌落表面的纹饰：

有皱纹、同心环、整个菌落致密。

菌落的质地：

革质状。

菌落的高度：

扁平。

菌落边缘：

全缘。

渗出物：

菌落表面无液体。

5.2.2个体形态：

菌丝的特征：

表面光滑

分生孢子梗：

分支复杂，轮生，较短，基部粗糙。

六分析：

6.1试验中我们发现,同种菌种在不同的培养基上面呈现出不同的菌落形态特征，如菌落形态大小、颜色、纹饰、质地、高度、边缘、有无渗出物及其渗出物的颜色等。

6.2试验中我们对各种材料进行了菌种分离，用了三种培养基，但由于操作原因和设备原因，试验中有很多培养基都被污染了。

七实验总结：

7.1植物的生长环境直接影响内生真菌的生物多样性，不同植株的内生菌种不同，不同环境中生长的同种植株的内生菌也可能不同。

7.2实验由于人数太多，导致超净工作台不够用，所以很多步骤中，接种或是菌体转移大多是在实验台上点上酒精灯进行，所以实验中出现很多培养基被污染，以后再超净工作台上进行实验是非常有必要的。

7.3关于内生真菌的分离表面消毒是非常重要的过程，通过提高杀菌剂浓度和处理时间、频率来保证表面消毒的彻底性、排除组织表面的污染菌;并设置对照确定所分离菌为表面消毒的叶、茎、根、花、种子或果实组织内部的真菌体培养后生长出来的。

7.4实验中分离到的菌属不仅与宿主物种有关，而且还与地域有关，这也充分证明了同一物种在不同地域生长过程中进化生长的内生真菌有很大区别。