毕业论文3种马尾藻中多酚类成分的提取分离和抗氧化活性研究.docx

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毕业论文3种马尾藻中多酚类成分的提取分离和抗氧化活性研究

本科生毕业论文

3种马尾藻中多酚类成分的提取分离和抗氧化活性研究

StudiesonSeparation,ExtractionandAntioxidantactivityofPolyphenolsinthreekindsofSargassum

学生姓名

李源

所在专业

食品质量与安全

所在班级

食安1104

申请学位

工学学士

指导教师

卢虹玉

职称

讲师

答辩时间

2014年5月31日

目录

摘要I

ABSTRACTII

1前言1

1.1目的和意义1

1.2国内外研究现状2

1.3主要内容和关键问题3

2材料和方法3

2.1实验材料、试剂和仪器3

2.1.1材料3

2.1.2主要试剂4

2.1.3主要仪器与设备4

2.2褐藻多酚的提取方法和步骤4

2.3总酚的测定5

2.3.1试剂的配制5

2.3.2检测方法5

2.3.3标准曲线的制定和样品含量计算5

2.4总抗氧化能力的检测6

2.4.1试剂的配制6

2.4.2检测方法6

2.5对DPPH·清除能力的检测6

2.5.1试剂的配制6

2.5.2检测方法6

3结果与分析7

3.1褐藻多酚的提取结果7

3.2总酚的测定7

3.2.1标准曲线7

3.2.2测定结果8

3.3总抗氧化能力的检测8

3.4对DPPH·清除能力的检测9

3.5展望10

4结论11

鸣谢12

参考文献13

摘要

本课题选取湛江海域的3种马尾藻属褐藻（硇洲马尾藻、铜藻和鲜鱼头草）为研究对象，对其中的褐藻多酚进行分离提取，并测定其总酚含量和多酚提取物的抗氧化活性及自由基清除率。

采用溶剂抽提法提取褐藻多酚，采用微晶纤维素粉吸附法进行纯化，Folin-Ciocalteu比色法测多酚含量，通过测定其总抗氧化性和DPPH·（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基）的清除率评价其抗氧化活性。

结果显示3种马尾藻的总酚含量分别为为0.36、0.39和0.26mg没食子酸（GA）/g海藻湿基；相同浓度下总抗氧化能力（TCA）为硇洲马尾藻＞鲜鱼头草＞铜藻；3种褐藻多酚提取物对DPPH·的半数清除浓度（IC50）大小依次为铜藻（IC50=83.701mg/L）＞硇洲马尾藻（IC50=86.699mg/L）＞鲜鱼头草（IC50=88.972mg/L）。

硇洲马尾藻、铜藻和马尾藻3种褐藻中褐藻多酚具有较强的抗氧化和清除自由基活性．是一类良好的海洋生物天然抗氧化剂和天然自由基清除剂，具有不错的应用价值。

关键词：

马尾藻；铜藻；褐藻多酚；DPPH自由基；抗氧化活性

ABSTRACT

ThePresentthesisisfoeusedonthestudiesoftheIsolation,Extraction,AntioxidantactivityandfreeradicalsscavengingactivityofthephlorotanninsinthethreekindsofSargassum（SargassumnaozhouenseTsengetLu,SargassumHorneriandTheSargassum）fromZhanjiangocean.PhlorotanninswereSeparatedbyMicrocrystallinecellulosesorptionmethodandextractedbySolventextraction,byFolin-Ciocalteucolorimetrydeterminationofpolyphenolscontent,bymeasuringtheTotalantioxidantcapacityandscavengingDPPH·（αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl）radicalassayofantioxidantactivity.ResultsshowedThetotalPolyphenolcontentsofthreekindsofSargassumswere0.36,0.39mgand0.26mggallicacid（GA）/galgaesamples,atthesameconcentrationalgaesamples,Totalantioxidantcapacity（TCA）wereSargassumnaozhouenseTsengetLu＞TheSargassum＞SargassumHorneri;ThreekindsofphlorotanninsextractDPPH·clearedhalfofconcentration（IC50）,followedbySargassumHorner（IC50=83.701mg/L）＞SargassumnaozhouenseTsengetLu（IC50=86.699mg/L）＞TheSargassum（IC50=88.972mg/L）.phlorotanninsfromSargassumnaozhouenseTsengetLu,SargassumHorneriandtheSargassumhadpromisingantioxidantandfreeradicalsscavengingactivity,whichcanbeusedasaresourceofnovelnaturalantioxidantsagents.

Keywords:

Sargassum;SargassumHorneri;phlorotannins;DPPH·freeradical;

Antioxidantactivity

3种马尾藻中多酚类成分的提取分离和抗氧化活性研究

食品质量与安全专业，2001011221115，李源

指导老师：

卢虹玉

1前言

1.1目的和意义

褐藻多酚具有显著的抗氧化活性[1-8]，能够起到良好的清除自由基、预防癌症的作用且对人体无害，适宜大量开发用作天然抗氧化剂。

寻求抗氧化活性的药物用于清除自由基具有重要意义，由于人工合成药物的毒性和成本问题，寻找具有抗氧化活性可清除自由基的天然产物是当前的研究热点[9-10]。

通常在有机物提取实验中，当醇含量为50%~60%时可除去淀粉等杂质；醇含量达60%时，无机盐开始沉淀；醇含量达75%以上时，可除去蛋白质等杂质；当醇含量达80%时，几乎可除去全部淀粉、多糖、蛋白质、无机盐类杂质，但是鞣质、水溶性色素、脂质等不易除去[11]。

所以，本课题选择用无水正己烷浸取除去样品中的脂质，用甲苯溶液过柱除去样品中的水溶性色素，用甲醇提取尽可能的除去淀粉，多糖，蛋白质，无机盐，用70%丙酮提取其中的褐藻多酚，如此操作可以较为有效地减少多糖和蛋白质对多酚提取的影响。

测定抗氧化活性的方法有很多种，但综合考虑成本及实验条件，磷钼络合物法有良好的可操作性和再现性，且成本低廉，适用于多种样品溶剂的抗氧化能力测定，故本课题选用磷钼络合物法测定褐藻多酚提取物的总抗氧化活性。

而二苯代苦昧酰基（DPPH·）法具有稳定、快速、简便、灵敏的优点，故选用DPPH·法评价提取物的自由基清除能力。

湛江作为我国大型海藻资源地之一，有着丰富的褐藻资源，尤其是硇洲马尾藻为湛江特有，且少见相关研究的报道。

这样的资源不加以利用太过于可惜和浪费。

不同中数的褐藻中褐藻多酚的含量差距很大，与藻体的大小、年龄、组织、盐度、季度、营养条件、光照条件及采摘后的保存时间和条件都有关系。

因此本课题选取3种典型的湛江产马尾藻：

硇洲马尾藻、硇洲产铜藻和鲜鱼头草，提取分离其中的褐藻多酚，并检测其含量、总抗氧化能力以及对自由基清除能力，综合评价其抗氧化活性。

为硇洲马尾藻、硇洲产铜藻和鲜鱼头草的开发利用提供一定依据。

1.2国内外研究现状

目前已知的属于海藻中褐藻门的海藻就有250属、1500多种，其中马尾藻属海藻分布广泛，种类繁多，常见种类有羊栖菜、海黍子、海蒿子、马尾藻、鼠尾藻等。

在广东经国际自然保护组织认定的就有60多种。

其特征均为含有褐色色素的丝原或丝状的植体的藻类，是海藻中一大比较高级的类群，具有生长快、易养殖、产量稳定、分布广等特点，有着巨大的潜在市场和经济价值，是非常引人注意的一类海藻，属于三大经济海藻。

马尾藻属是提取褐藻胶等天然物质的重要原料，一些马尾藻在在《本草纲目》、《神农本草经》、《千金方》、等著作中收录作为药用。

广东沿海地区的产量每年产量25万担（干品）左右，其中湛江的产量约占四分之一。

其生长在低潮带的马尾藻，有着较易于采集的优点，再加上生长迅速，植株较大，研究利用和开发就有了便利的条件[12]。

而湛江作为我国马尾藻的主要产地之一，具有得天独厚的优势。

多酚是一大类结构不同、含有多个羟基的化合物总称,在植物中广泛存在。

但随着现代化学分析和物质分离技术的成熟，并大量应用于藻类资源的开发及对褐藻的次级代谢产物——褐藻多酚化合物（phlorotannins）逐渐深入的研究,褐藻多酚越来越引起研究者和药食品从业者的关注。

抗氧化剂可分为天然抗氧化剂和人工合成抗氧化剂两种。

由于天然抗氧化剂需要养殖，提取等等繁琐的工序，因此在食品工业一些人工合成抗氧化剂如二丁基羟基甲苯（BHT）、丁基羟基茴香醚（BHA）、叔丁基对苯二酚、没食子酸丙酯被大量使用。

虽然生产快速，成本低廉，但人体在长期高剂量的摄入后，会导致细胞突变从而患上癌症。

已有大量事实证明，在食品中，就毒性而言，天然抗氧化剂要远比人工合成抗氧化剂的毒性低的多。

民以食为天，随着人们对食品安全的持续关注，天然抗氧化剂在食品添加剂和保藏鲜肉果蔬食物领域中有着广阔的应用前景[1]，而褐藻多酚也因其良好的抗氧化性引起了广泛关注[2]。

就现阶段而言，已经被大量开发和应用的褐藻产物主要是褐藻盐（Aliginates）和褐藻酸（Alginic），约占褐藻干重的15-40%[13]，它们具有抗凝血及抗微生物活性，可以降低血液中的胆固醇含量。

而褐藻多酚的研究工作国外早已开展多年，steinberg[14]对多种褐藻中多酚含量及其摄入威胁性进行了研究。

随着植物单宁化学本质的不断显示,以及T.swainlss[15][16]等不断地强调植物代谢产物的生理活性和功能,才推动了酚类物质的生物学研究。

其它的研究还包括Ragan在1979和1980年对褐藻多酚与重金属离子络合作用。

一些国外生物学者对空茎昆布（Eckloniacava）、黑海藻（blackseaalgae）[18]等海藻中多酚的提取方法、含量、抗氧化性能等进行了大量的研究。

但在国内还未尚未有深入系统的研究。

严小军（1994）[17]是国内研究褐藻多酚较早的学者之一。

他对中国常见的几种褐藻比如裙带菜（Undariapinnatifida）、海黍子（Sargassumkjellmanianum）、海带（Laminariajaponica）、鼠尾藻（Sargassumthunbergii）和几种马尾藻中多酚含量进行了测定。

从目前已有的相关研究报导中，普遍认为在马尾藻、墨角藻、水云属等褐藻中多酚含量较多[19-20]。

迄今为止，国内外报道的提取分离褐藻多酚的方法主要超声波提取法、微波提取法、超临界流体萃取法、吸附树脂法、高速逆流色谱法和有机溶剂萃取法等[21]。

国内外报道的测定褐藻多酚抗氧化物质清除自由基的方法主要有紫外-可见光分光光度法、化学发光法、电子自旋共振法、电化学检测法、荧光法、气相色谱法和超高效液相色谱串联质谱法等[22]。

目前，1，1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH·）清除实验被广泛用于抗氧化活性的测定，具有稳定、快速、简便、灵敏的优点。

国外很多学者运用DPPH溶液的紫外-可见光分光光度计的吸光度变化作为清除DPPH自由基能力的测定方法[23-24]。

硇洲马尾藻（SargassumnaozhouenseTsengetLu）属于褐藻门（Phaephyta）圆子纲（Cyclospreae）墨角藻目（Fucales）马尾藻科（Sargassaceae）马尾藻属（Sargassum）[12]，其为广东特有物种，主要分布于硇洲岛和雷州半岛等地，多生长在中低潮带的岩石上。

硇洲马尾藻具有高蛋白、低脂肪、低热量、高膳食纤维且富含锌、铁、钾等微量矿质元素的优点，是理想的天然保健食品原料[25]，有着很高的药用和食用价值，是南方高温海区非常具有规模化栽培前景和商业价值的本土种类。

其重要作用还体现在海洋生态系统中，可用作实施海洋生态修复或重建浅海藻场。

铜藻（Sargassumhorneri）属于褐藻门（Phaephyta）圆子纲（Cyclospreae）墨角藻目（Fucales）马尾藻科（Sargassaceae）马尾藻属（Sargassum），又称草茜、竹茜菜、柱囊马尾藻，铜藻可用于堆肥或作为季节性食材，甚至发展成为发酵生产酒精的原料。

其分布区很广，南可至香港，是一种常形成海藻林的常见温带马尾藻，能在每年的冬末春初大量繁殖，最快时每天可以长约一米，最长的个体可达十米[12]。

硇洲岛是广东的主要铜藻产地之一，其易养殖、收割，且产量高，目前相关市场开发程度较低，其实具有较高的食用和药用价值，可进行更多的生产提取，如可用来制铜藻罐头、动物饲料和天然抗癌药物。

鲜鱼头草属于褐藻门（Phaephyta）圆子纲（Cyclospreae）墨角藻目（Fucales）马尾藻科（Sargassaceae）马尾藻属（Sargassum）。

其藻株高约10~20cm，叶略卷曲，宽约0.5~1.0cm，呈褐色，是典型的马尾藻，目前暂时只有俗名，正在鉴定中的马尾藻。

1.3主要内容和关键问题

本课题的主要研究内容是从已有的研究基础及相关文献报道着手，参考FedericoFerreres,GracilianaLopes,AngelGil-Izquierdo等人的方法[26]提取，Folin-Ciocalteu比色法[27]测定褐藻多酚含量，磷钼络合物法[28]检测总抗氧化能力，二苯代苦昧酰基自由基（DPPH·）法[21-22]检测自由基清除能力，对3种湛江本地产的马尾藻中褐藻进行检测来验证其褐藻多酚含量、抗氧化性和自由基清除能力。

本课题将进行以下内容：

①褐藻多酚的提取分离；

②褐藻多酚含量的测定；

③褐藻多酚总抗氧化能力的检测；

④褐藻多酚的DPPH·自由基清除能力检测。

2材料和方法

2.1实验材料、试剂和仪器

2.1.1材料

硇洲马尾藻，铜藻，鲜鱼头草均在湛江硇洲岛采集。

2.1.2主要试剂

folin-酚试剂（北京鼎国生物技术有限公司），没食子酸（GA）（福建南方化工有限公司，色谱纯），无水Na2CO3（分析纯），三水合醋酸钠（分析纯），冰乙酸（分析纯），TPTZ试剂（美国Sigma公司），浓盐酸（分析纯），六水合三氯化铁（分析纯），DPPH试剂（美国Sigma公司），无水乙醇（分析纯），正己烷（分析纯），丙酮（分析纯），甲醇（分析纯），甲苯（分析纯），浓硫酸（分析纯），七水合硫酸亚铁（分析纯），微晶纤维素（国药集团化学试剂有限公司，柱层析），实验用水如无特殊说明均为超纯水。

2.1.3主要仪器与设备

仪器名称

型号

生产厂家

真空旋转蒸发仪

DIGITALWATERBATH

循环水式真空泵

N-1000

SB-1000

SHZ-D（Ⅲ）

EYELA

EYELA

巩义市予华仪器有限责任公司

数显恒温水浴锅

HH-8

常州澳华仪器有限公司

紫外分光光度计

UV2550

日本岛津公司

高速冷冻离心机

CR22GⅡ

日本日立公司

超声波清洗器

KQ-500E

昆山市超声波仪器有限公司

电子天平

AUY220

SHIMADZU

超纯水机

LD-50G-D

重庆利迪实验仪器设备有限公司

摇床

SKY-1102C

SUKUN

电热鼓风干燥箱

DHG-9240A

上海-恒科学仪器有限公司

无菌注射针筒

50ml

中国医疗器材公司

2.2褐藻多酚的提取方法及步骤

①3种新鲜马尾藻样品在采集之后,用清水反复清洗除去附生生物后，再用蒸馏水洗涤3次,然进行植株的物种鉴定，放置于冰箱中零下20℃低温保存备用。

实验时取出保藏的3种马尾藻，在研磨钵中研磨碎后，用电子天平分别于广口瓶中3次平行称取66.89g马尾藻，25.34g铜藻，31.41g鲜鱼头草备用。

②按质量体积比1:

6（样品：

正己烷）加入正己烷溶液，使样品完全浸没后，放置在摇床上（25℃，120r/min）摇晃以加快浸取速度，经过6h后，浸取完毕。

同中等密度滤纸过滤，滤渣按上述方法重复提取3次，确保除去脂质。

之后将滤渣倒出广口瓶置于滤纸上，自然干燥滤渣12h，确保正己烷已经挥发不会影响下面的实验。

获得3种马尾藻的粗提物I。

③再按照质量体积比1:

6（滤渣：

70%丙酮溶液）加入70%丙酮溶液，使样品完全浸没后，放置于摇床上（25℃，120r/min）晃动浸取1小时，4000r/min离心5min，按上述方法重复提取3次，合并离心液，得粗提液。

④将离心液倒入500ml旋蒸瓶中置于真空旋转蒸发仪（40℃，85r/min）蒸馏去丙酮和水。

然后加入甲醇溶液以超声波清洗器溶解附着在旋蒸瓶上的提取物，换250ml旋蒸瓶，用旋转蒸发仪（40℃，85r/min）旋蒸干燥至恒重后，3次平行，用差量法算出提取物的质量分别为2.77g、1.63g、1.25g。

得3种马尾藻粗提物II。

再以甲醇溶解，加入2倍质量的微晶纤维素，继续旋蒸干燥得到微晶纤维素提取物。

⑤将微晶提取物从旋蒸瓶中倒出后，以50ml针筒过柱，具体步骤如下

首先在针筒底部塞入一层棉花，确保微晶颗粒不会由针筒口流出，接着加入一层微晶纤维素约2药勺，然后放入旋蒸干燥好的纤维素提取物，再在上面覆盖一层微晶纤维素，确保充分提取。

把甲苯缓缓倒入针筒中，使甲苯通过两层纤维素后由针筒口流出，反复操作，过柱直至甲苯洗出液呈无色，收集洗出液。

然后加入70%丙酮，使70%丙酮通过两层纤维素后由针筒口流出，提取3次，收集并合并洗出液后，4000r/min离心5min，即得到丙酮提取液。

⑥将提取液在真空旋转蒸发仪中30°旋蒸除去其中混杂的甲苯和丙酮，待无液体蒸出后，用超声波震荡使得附着于璧山的提取物溶解，所得溶液即为最终样液，放置于冰箱中零下20℃保存。

⑦将实验中用到的各种有机溶剂在旋转蒸发仪中旋蒸以回收有机溶剂，供反复使用。

2.3总酚的测定

2.3.1试剂的配制

880mg/L没食子酸标准液：

准确称取0.044g没食子酸，用水溶解，定容至50ml。

12%Na2CO3溶液：

准确称取无水Na2CO313.0g溶于40ml水中，定容至100ml。

1mol/Lfolin-酚试剂乙：

取一定量的folin-酚试剂乙原液以1:

1比例稀释后待用。

2.3.2检测方法

根据相关文献，采用Folin-Ciocalteu比色法[13]。

Folin-酚乙液可与多酚在碱性条件下发生氧化反应，形成钨钥兰复合物，复合物呈蓝色，在避光条件下反应60min后达到稳定状态，复合物在λ=765nm处有最高吸收峰并无干扰峰，在一定浓度范围内，其吸光度变化值与总酚含量呈比例关系，故可依据标准曲线得出对应浓度，用没食子酸（GA）mg/g海藻湿基来表示海藻的多酚含量。

实验具体操作如下：

用移液管量取1ml待测液于10ml具塞试管中，然后准确加入2ml1mol/LFolin-酚乙液，震荡摇匀，然后静置2min，接着缓慢的加入6ml的12%Na2CO3，防止溶液冲出试管，迅速摇匀，用超纯水定容至10ml，室温下避光放置60min使反应稳定后，用紫外-可见分光光度计在λ=765nm处测定吸光度，以1ml超纯水代替样品进行上述过程，作为空白对照。

以没食子酸作为衡量多酚含量的标准。

得相对的褐藻多酚总含量，用mgGA/g海藻湿基表示。

2.3.3标准曲线的制定和样品含量计算

取配制好的没食子酸标准溶液配制系列浓度为0、2.2、4.4、6.6、8.8mg/L，采用2.2.2中的Folin-Ciocalteu比色法，建立浓度和吸光度的关系曲线（图1）作为标准曲线。

代入测得的样品吸光度值，即可得出样品的相对GA浓度，换算可得每克样品相对GA含量。

2.4总抗氧化能力的检测[8]

2.4.1试剂配制

试剂液（内含0.6mol/L硫酸、28mmol/L磷酸钠和4mmol/L钼酸铵）：

量取16.30ml98%H2SO4，用超纯水稀释一定程度后，再称取2.4716g四水合钼酸铵和5.32g十二水合磷酸钠，用一定超纯水震荡溶解于烧杯后，再将溶液倒入上述装有稀释硫酸的容量瓶中，用超纯水定容至500ml。

2.4.2检测方法

采用磷钼络合物法[28]。

其测定原理是抗氧化物质将Mo（Ⅵ）还原后生成绿色的Mo（V）络合物，在695nm处有最大吸收峰且无干扰峰。

测得的吸光度值在一定范围内与被测物质的抗氧化物质活性成比例关系。

故可通过比较3中马尾藻样品的吸光度，得出其抗氧化性大小的顺序。

该方法有良好的可操作性和再现性，且成本低廉，适用于多种样品溶剂的抗氧化能力测定。

具体操作步骤参考Prieto等[28]的方法并加以改进：

用移液管准确量取0.5mL样品液于5ml试管中，接着量取并加入4.5mL试剂液，充分摇匀。

然后在恒温水浴90min，待反应稳定后，迅速用紫外-可见光分光光度计于λ=695nm下测吸光度，比较3种待测褐藻多酚溶液的总抗氧化能力强弱。

用0.5mL溶剂代替样品液按上述步骤操作用作空白液。

2.5对DPPH·清除能力的检测[5,13,21-22,24]

2.5.1试剂配制

0.2mmol/LDPPH乙醇溶液：

称取0.0040gDPPH试剂用无水乙醇溶解，定容至50ml。

2.5.2检测方法

测定方法采用二苯代苦昧酰基自由基（DPPH·）法。

其具有简单、快速的特点，仅需一台紫外-分光光度计就可以测定，试剂配制也十分容易。

DPPH·是一种稳定的以氮为中心的自由基，其醇溶液呈深紫色，在λ=517nm处有一吸收峰且无干扰峰。

加入自由基清除剂可与DPPH·发生氧化还原反应而使其颜色变浅，从而使517nm处的吸光度减小且颜色变化与吸光度成比例关系。

故根据吸光度值的变化可测得抗氧化剂的活性，从而评价实验样品的抗氧化能力。

取5ml具塞试管，将3种马尾藻褐藻多酚提取液分别稀释为18mg/L、40mg/L、60mg/L、120mg/L、180mg/L的系列，并按照如下过程操作。

0管：

加入1ml超纯水，2ml无水乙醇溶液，用无水乙醇定容至5ml。

对照组：

加入1ml样品溶液，2ml无水乙醇溶液，用无水乙醇定容到5ml。

样品组：

加入1ml样品溶液，2ml0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液，用无水乙醇定容到5ml。

空白组：

加入1ml超纯水，2ml0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液，用无水乙醇定容到5ml。

将上述试管于暗处放置60min待反应完全后，用紫外-可见光分光光度计在λ=517n