阿尔茨海默症动物模型.docx

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阿尔茨海默症动物模型

阿尔茨海默症动物模型

动物模型阿尔茨海默病模型大鼠的构建

背景阿尔茨海默病（Alzheimer’Sdisease，AD）是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。

主要表现为进行性认知功能障碍、记忆力减退、运动行为失常和人格改变等；其主要组织病理学特征是神经元胞外出现β?

淀粉样蛋白（Aβ）聚集形成的神经炎性斑［NPs，亦称老年斑（SPs）］、胞内tau蛋白异常磷酸化形成的神经原纤维缠结（NFTs）、神经元凋亡或缺失、突触缺失等。

随着我国近年来人口老龄化越来越严峻，AD发病率显著提高，在阿尔茨海默病相关研究中，建立理想的动物模型颇受关注，这有利于促进阿尔茨海默病病因、发病机制、病理过程，以及寻找和筛选预防与治疗药物等研究的深入。

AD动物模型研究进展目录CATALOGAD动物模型学习评价AD模型大鼠的研究方案

01AD动物模型研究进展

实验动物的选择许多动物都可以成为模拟阿尔茨海默病病理学特征的模型，包括鼠、猫、犬、兔、山羊、绵羊、北极熊和非人类灵长类动物等。

其中，小鼠和大鼠相对于其他动物价格便宜、繁殖力强、生存率高、易饲养，有利于进行大样本实验研究，而且具有较强的快速学习能力，生理过程接近人类，因此小鼠和大鼠代是目前最广泛用于制备阿尔茨海默病模型的动物。

国内外AD动物模型研究进展01以衰老为基础的AD模型自然衰老的动物模型快速老化小鼠模型02各种因素诱发的AD模型化学损伤物理损伤饮食诱导03转基因AD模型APP转基因模型PS1转基因模型tau相关模型多重转基因模型

以衰老为基础的AD模型AD是一个与年龄密切相关的疾病，衰老因素在AD发病过程中起着重要作用。

以衰老为AD发病基础的动物模型成为实验研究中不可或缺的部分自然衰老AD模型自然衰老动物模型脑内神经元萎缩，胆碱能功能低下，同时表现为感觉、运动以及学习记忆力等多种功能的减退，这符合AD患者的临床表现。

造模方法：

将1~2月龄小鼠或3~5月龄大鼠，雌性或雄性，饲养在屏障环境的动物实验室，直至饲养所需的年龄。

常用老年动物的年龄为小鼠12~24月龄，大鼠衰老早期21~26月龄，衰老晚期30~32月龄。

此模型的优点：

动物脑内的神经递质及形态学改变是自然发生的，与AD真实的病理生理改变更为接近，不需要人为损伤、干预。

缺点：

只是模拟了部分与人类正常衰老相关的神经改变，缺乏AD相关Aβ沉积及NFT，并不能全面模拟AD的变化。

且动物饲养周期和实验周期长、病死率高。

以衰老为基础的AD模型快速老化小鼠模型1975年日本京都大学Take-da教授培养出快速老化小鼠（senescenceacceleratedmouse/prone，SAMP）。

此后，根据小鼠衰老程度、寿命和病理表现进行选择性繁殖，其中SAMP8作为AD动物模型被广泛认可。

此模型优点：

SAMP8既有自然衰老小鼠特征，又有类似AD脑部病理改变及学习记忆障碍，已被广泛应用于研究与年龄相关的学习记忆障碍的机制及相关的药物研发中缺点：

该模型成本较高，小鼠寿命短，不适合用于长周期实验。

各种因素诱发的动物模型01化学Aβ注射诱导模型东莨菪碱诱导的模型侧脑室注射链脲菌素诱导模型……02物理剥夺动物供氧的模型03饮食高脂饮食诱导模型硫胺素缺乏诱导模型

化学损伤致AD模型Aβ注射诱导模型脑内Aβ代谢产物的沉积是AD发病机制中最重要的一点。

Aβ的沉积可引起神经元的局灶性坏死、神经元缺失和神经胶质细胞增生，最终引起相应的胆碱能神经元功能的丧失和学习记忆减退的损害。

造模方法：

大多数是通过注射Aβ到实验动物海马区来实现，剂量范围在5~10μg之间，体积多为5μL。

方法有单侧海马内注射、双侧海马内注射等，注射后应留针10min，以保证溶液充分弥散。

此模型的优点：

动物脑内的神经递质及形态学改变是自然发生的，与AD真实的病理生理改变更为接近，不需要人为损伤、干预。

缺点：

只是模拟了部分与人类正常衰老相关的神经改变，缺乏AD相关Aβ沉积及NFT，并不能全面模拟AD的变化。

且动物饲养周期和实验周期长、病死率高。

化学损伤致AD模型东莨菪碱诱导的模型乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）是一种重要的中枢神经递质，在学习、记忆方面起着非常重要的作用。

AD患者基底前脑胆碱能神经元大量损伤或死亡、突触前乙酰胆碱的合成、ChAT的活性及对胆碱的摄取能力都明显下降。

这些变化的程度与患者认知功能损害的程度呈正相关。

造模方法：

东莨菪碱为M胆碱受体阻断剂，3mg·kg-1东莨菪碱腹腔注射60d，可阻断小鼠大脑皮层中乙酰胆碱受体的结合位点，小鼠出现胆碱能神经系统障碍的一系列行为学改变，如记忆力下降、认知障碍等。

此模型的优点：

简便易行、不需手术、费用较低，是应用广泛的AD模型建立方法之一，主要用于考察胆碱能系统与AD的关系及相关药物临床前评价。

缺点：

只模拟了胆碱能功能减退的特征，缺乏AD典型病理特征，如神经元变性、Aβ沉积等。

化学损伤致AD模型侧脑室注射链脲菌素诱导模型链脲菌素（streptozotocin，STZ）是一种烷基化物，腹腔注射可通过破坏胰腺β细胞引起糖尿病。

1998年Lannert和他的同事首次建立侧脑室注射STZ动物模型，动物出现类似AD的记忆障碍。

方法：

将大鼠固定于脑立体定位仪上，在前卤后1.5mm，矢状缝侧方1.5mm处钻孔，微量进样器注射STZ3mg·kg-1，于手术的第1天和第3天分别二次向侧脑室注射。

小剂量STZ侧脑室注射可以制备痴呆模型。

此模型优点：

模拟了散发性老年痴呆病的许多重要的特点。

缺点：

造模过程中动物的死亡率较高。

以化学为基础的AD模型冈田酸诱导的损伤模型tau蛋白过度磷酸化是引起AD病理改变的重要机制。

调节tau去磷酸化的蛋白磷酸酶主要有蛋白磷酸酶-2A（PP2A）、PP2B、PP2C和PP1冈田酸（OA）是一种海洋生物提取物，对PP2A和PP1有选择性抑制作用。

方法：

大鼠侧脑室注射OA0.4mmol·L–1，1.5μL，可引起神经细胞的变性、坏死，同时促进脑内异常磷酸化tau蛋白的形成，还能造成Aβ聚积，产生类似AD样病理特征。

兴奋性毒素损伤模型在AD患者中，兴奋性毒素过度刺激谷氨酸受体导致神经元死亡。

造模方法：

将溶于人工脑脊液的IBO注入大鼠Meynert基底核（nucleusbasalisofmeynert，NBM），每只10μg，通过损毁大鼠单侧NBM来建立AD模型，动物表现出明显的学习记忆障碍。

秋水仙碱诱导模型秋水仙碱可选择性破坏海马神经元，破坏胆碱能神经通路，使动物出现短期学习记忆障碍。

方法：

侧脑室注射秋水仙碱（大鼠15μg、小鼠2.8μg）可导致动物在2周后出现明显的学习记忆障碍。

以化学为基础的AD模型重金属诱导模型AD脑组织内铝的含量明显高于正常人，高浓度铝对神经系统有毒害作用，促进大脑内NFT和Aβ聚集，使神经元变性或死亡，表现为大脑皮质萎缩，出现记忆，认知功能障碍。

方法：

利用这一机制，小鼠侧脑室注射0.5%AlCl32μL，每天1次，连续5d，末次注射15d后，小鼠表现出明显的空间学习障碍。

此外小鼠连续腹腔注射AlCl3100mg·kg-1，周期50d，隔日1次，也可造成记忆损伤模型。

叠氮钠诱导模型有研究表明，AD患者线粒体功能存在明显异常。

叠氮钠（NaN3）通过抑制线粒体呼吸链，产生自由基，抑制能量代谢，造成线粒体损伤，导致一系列类似AD的病理改变。

方法：

大鼠皮下长期给予NaN33mg·kg-1，2h皮下间断注射，每天8次，连续注射4周，可诱导Aβ沉积，出现类似AD的认知障碍。

谷氨酸损伤模型过量的谷氨酸可产生严重的神经兴奋毒性，造成神经元损伤或死亡，与AD的发生、发展有密切的关系。

方法：

利用新生乳鼠血脑屏障功能不全，外周注射谷氨酸25mg·kg-1，40d后小鼠肥胖，基底前脑多处神经元变性，脑内APP免疫阳性改变，细胞间隙的Aβ大量沉积。

物理损伤致AD模型慢性缺氧动物模型AD模型研究发现AD患者处于长期慢性缺氧的状态。

通过剥夺啮齿类动物的供氧，可诱导与老化脑功能相似的能量代谢障碍。

方法：

研究提示动物经由双侧颈总动脉结扎致全脑缺血12min，后复灌24h，会引起行为学上的障碍，并且脑组织出现与AD患者相似的病理特征。

该模型的缺点：

可以模拟AD的临床症状，但缺乏AD特异性胆碱神经损伤以及Aβ沉积。

且由于创伤较大，不相关的干扰因素过多，易引起脑内其他部位的损伤及造模动物的死亡。

因此，该模型成功率低，现在已很少使用。

饮食诱导AD模型高脂饮食诱导模型有报道指出动物给予高脂饲料饲养可降低大脑对葡萄糖的摄取，诱导动物模型产生糖耐量降低及胰岛素抵抗，亦可损伤神经元胰岛素受体功能，引起tau蛋白过度磷酸化，从而导致NFT。

方法：

大鼠给予高脂饮食2个月后，即出现胰岛素抵抗，表现出明显的空间学习记忆障碍。

该模型可以模拟AD的一些病理特征，例如认知障碍及tau蛋白过度磷酸化，主要的缺点是造模时间较长。

硫胺素缺乏诱导模型硫胺素缺乏（thiaminedeficiency，TD）诱导的能量代谢下降、糖代谢异常、氧化应激损伤、胶质细胞激活、选择性神经元丢失以及认知功能损害，与AD的病理生理过程极为相似。

方法：

8周龄C57小鼠，通过给予硫胺素剥夺饮食结合腹腔注射硫胺素焦磷酸激酶抑制剂—吡啶硫胺制作硫胺素缺乏模型，造模13d后取脑，模型组小鼠内侧丘脑出现典型的对称性针尖样出血，小鼠皮质、海马及丘脑均出现Aβ沉积，tau蛋白磷酸化。

TD可引起Aβ沉积、tau蛋白磷酸化增加等AD的特征性病理改变。

转基因AD模型转基因模型是研究AD发病机制及相关药物研发的较理想工具，同时也成为了近年研究的热点。

APP转基因模型APP正常情况下代谢多经过α-分泌酶和γ-分泌酶。

基因突变时，激活了β-分泌酶和γ-分泌酶，导致Aβ增多，尤其是Aβ42。

Aβ聚集可形成具有神经毒性的原纤维，进而形成SP，加重AD的发展。

方法：

将突变APP基因（Val717-Phe）与血小板衍生因子（plateletderivedgrowthfactor，PDGF）相结合形成PDAPPPS1转基因模型位于12号染色体上的早老素－1（PS1）基因，及位于1号染色体上的早老素－2（PS2）基因发生突变与家族性AD发病有着密切关系。

PS1M146V小鼠是比较典型的转PS1基因动物。

Catado等利用血小板源性生长因子β2启动子促进神经元的表达，构建了几种过度表达突变型PS1的转基因鼠，发现可导致选基因，导入到小鼠体内，获得PDAPP小鼠。

择性增加Aβ42。

优点：

APP转基因小鼠及APP/PS-1双转基因小鼠是目前国际最为认可的AD动物模型，其病理变化出现较早且明显，模拟了AD患者脑内的Aβ增多、SP形成。

缺点：

模型小鼠脑内产生的Aβ与AD患者脑内的Aβ存在生化组成的差别，并且这些小鼠脑内没有发tau蛋白磷酸化及NFT，也没有表现出AD患者特有的海马及皮层神经元丢失。

这也是多数转基因小鼠模型的缺陷。

转基因AD模型转基因模型是研究AD发病机制及相关药物研发的较理想工具，同时也成为了近年研究的热点。

神经元纤维缠结、tau相关模型AD患者大脑皮质及海马区出现NFT的主要原因是tau蛋白的过度磷酸化。

因此认为tau基因突变将直接影响tau蛋白的结构和功能，引发神经系统疾病，可能是诱发AD的因素之一。

JNPL3小鼠是将人类FTDP-17突变tau基因导入B6D2（F1）小鼠，然后将其下一代小鼠与C57BL/6回交而获得。

多重转基因模型AD的发病过程复杂，与脑内多种基因调控失调有着密切联系，多种转基因组合方法可以非常成功模拟AD病理变化和行为学改变特征，是较为理想的AD动物模型。

双转基因小鼠Tg2576/tauP301L小鼠是由Tg2576小鼠和tauP301L（JNPL3）小鼠杂交而来，其行为学的发病方式及出现时间和JNPL3相似，Aβ的沉积同Tg2576小与表达人基因组MAPT基因的小鼠杂交获得。

此模型已经成为研究NFT病理特征及相关tau蛋白生化的有力工具。

转基因AD模型转基因果蝇模型研究表明，在已知的人类疾病致病基因中，果蝇具有约75%的同源基因，包括AD所涉及的Appl，Pen-2，Nicastrin，tau以及GSK-3β等基因。

除了具有大量的同源基因外，果蝇的神经退行性疾病模型与人类神经退行性疾病还有许多相似的表型，如迟发性、进程性和神经系统的高毒性。

因此，果蝇为研究AD发病机制以及进行治疗药物的筛选和验证提供了另一种模式生物方法。

常用的转基因果蝇模型主要有APP转基因模型、BACE转基因模型、Aβ转基因模型、tau蛋白转基因模型、双重或多重转基因模型等。

优点：

果蝇因其基因背景清晰、生命周期短暂、与年龄相关的神经元退化明显、繁殖迅速以及易于培养观察等特点在AD模型中具有独特优势。

另一方面，可以用果蝇模型直接对已有的大量药物进行筛选，以期获得改善疾病症状的药物，加快哺乳动物乃至人类的药物实验。

缺点：

是其肠胃酸碱度以及吸收食物的途径与哺乳动物差别较大。

02AD动物模型学习评价

学习评价上述AD动物模型各有其优缺点，多数仅能部分模拟AD的病理学特征及临床症状，尚无一种公认最理想的模型。

即使是目前最为广泛使用并认可的多重转基因动物，也有待于进一步完善。

理想的AD动物模型应具备以下3个方面的特征：

?

具有AD的主要神经病理学特征—SP和NFT；?

出现大脑神经元死亡、突触丢失和反应性胶质细胞增生等AD的重要病理变化；?

出现认知和记忆能障碍。

03AD模型大鼠的研究方案

AD模型大鼠的研究方案研究目标、研究内容0104增殖细胞标记动物模型制备、分组给药0205动物处理干预措施0306检测指标

研究目标1明确毛冬青甲素影响阿尔茨海默大鼠脑海马组织神经元再生的作用。

2从BDNF表达水平的影响揭示毛冬青甲素促进神经元再生的作用机制，为中医药防治阿尔茨海默病提供实验依据和作用靶点。

研究内容12检测毛冬青甲素对阿尔茨海默模型大鼠海马神经元再生的影响，通过检测毛冬青甲素对阿尔茨海默模型大鼠海马神经元BDNF水平的影响，采用免Aβ海马注射大鼠模型，采用尼式染色法观察、Brdu标记增殖细胞，用ImageProPlus6.0图像处理系统进行细胞计数。

疫组化法检测海马组织中BDNF的表达，采用分子探针检测BDNFmRNA的表达情况。

动物模型制备及分组给药药物毛冬青甲素购于广东省博罗先锋药业集团有限公司实验动物SD大鼠36只，清洁级，180-220g，雌雄各半。

湖南中医药大学SPF级动物实验中心提供动物造模大鼠适应性喂养一周后，参考相关文献选择Aβ海马注射大鼠模型，将SD大鼠用10%水合氯醛按4mL·kg-1的剂量行腹膜麻醉后，固定于脑立体定位仪上，备皮，消毒，沿颅顶中线做1-2cm切口，分离骨膜，找到前囱位置，参照《大鼠脑立体定位图谱》，确定前囟后3.0mm，中线旁2.0mm为海马CA1所在部位体表投影位置，以牙科钻钻开一骨窗，微量注射器固定于立体定位仪上，自脑表面垂直进针约2.8mm，假手术组脑内注射等体积的生理盐水；其余各组两侧海马各缓慢均匀注入1μlAβ25-35，5min注射完毕，留针5min，然后缓慢撤针，缝合皮肤并涂红霉素软膏，肌注青霉素，预防感染。

清醒后放回笼中常规饲养。

动物模型制备及分组给药模型评价在造模第20天，对所有大鼠称重，并进行蔗糖水消耗实验和Morrsi水迷宫实验，最后根据实验结果评定大鼠是否造模成功。

动物分组对造模成功的大鼠随机分成3组，每组12只，分别为假手术组、模型组、毛冬青甲素组。

干预措施01毛冬青组于造模后第3d起开始用药，02假手术组03模型组毛冬青甲素组舌下静脉注射30mg·﹙kg·d﹚-1，每天两次，连续给药4周。

无干预措施无干预措施

增殖细胞标记给药25天后，每组取6只，雌雄各半，将Brdu按照50mg/kg的剂量，10mg/ml浓度溶于生理盐水，腹腔注射2次/天，每次间隔2h，其中最后一次在处死前24h注射。

动物处理在给药后的第28天，将大鼠用10%水合氯醛按4mL·kg-1的剂量腹膜麻醉。

麻醉成功后，取仰卧位固定四肢。

剖开胸腹充分暴露心脏与肝脏，剪开左侧心尖部，剪开右心耳，插导管于左心室并固定，穿刺针经左心室穿刺至升主动脉，快速灌注生理盐水至肝脏完全变白，右心耳流出完全清亮液体后，予4%的多聚甲醛液灌注﹙先快后慢﹚，见大鼠尾巴、四肢僵硬视为满意。

然后将注射了Brdu的大鼠开颅完整取出鼠脑，保留海马部位，切去多余部分，经后固定48h后常规石蜡包埋。

其余大鼠断头取脑，取出海马组织，投入液氮保存。

检测指标海马组织细胞形态结构观察采用Nissl染色法进行观察海马增殖细胞检测免疫组织化学检测Brdu标记的增殖细胞脑源性神经营养因子的检测采用免疫组化法检测海马组织中BDNF的表达，采用分子探针检测BDNFmRNA的表达情况。

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