卫生化学实验归纳预防医学.docx

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卫生化学实验归纳预防医学

ICP发射光谱测头发样品中的元素

【试剂和仪器】

中性洗发液、丙酮、无水乙醇、混合酸、去离子水，钙铁锌标准品。

100ml烧杯2只，10ml比色管1个，玻璃棒，剪刀，电子天平，烘箱，滤纸。

日本岛津公司ICPS-7000型电感耦合等离子体原子发射光谱仪，高纯氩气，通风装置，循环水系统，容量瓶，移液管。

【实验步骤】

1、消化处理

采样：

后枕部头发距头皮1~3cm（为了反映近期金属元素蓄积的情况）样品量约为0.05g。

洗涤：

中性洗发液洗涤→蒸馏水洗净（约3-5遍）→去离子水洗至无泡沫→淋干后放在丙酮中浸泡2min（去除有机污染物）→无水乙醇中浸泡1min→滤干→110℃干燥箱中干燥0.5h

消化：

精称取样品0.025g左右→混合酸5ml（10min）→电炉上徐徐加热（120℃左右）→溶液由棕褐色变至淡黄色，加大火，200℃左右赶酸（小于1ml为宜）。

若为较深的黄色，则继续加数滴混合酸（完全冷却后）电炉上加热直至残渣为白色时消化完成。

注：

混合酸是为了增加氧化性（硝酸：

高氯酸=4:

1，适用于含钙较高的材料）；所有试剂为优级纯

稀释：

1%HNO3溶解后→去离子水少量多次（至少3次）将样品转移至10ml容量瓶中定容，摇匀。

贴签备用（注：

吸取硝酸和搅拌的吸管用两根，避免损失及污染）

2、仪器基本操作方法

（1）打开主机电源，预热3h以上。

（2）打开循环水装置，接通氩气，打开通风罩。

（3）打开电脑，进入ICPS操作系统，首先观察仪器状态是否正常，点燃距焰，（此时毛细管不能空吸）吸入空白溶液，进行波长校正（通常使用O/C/Ar）。

S<50，表示误差在允许范围内，若S>50,应重复校正一次。

（4）然后建立新文件（makenewcard→命名→定性or定量→设一些参数,如测量次数，为3次，最后取平均值→选要测的元素→选波长→设置测量条件，采用人工方法进样，将样品提升时间设为0→设置标准系列样品浓度），根据测量需要设定条件。

（5）测定标准系列和样品。

（6）测定结束后，应先关闭氩气阀门，待距焰熄灭后，再关闭电源。

3、标准曲线的绘制

（1）首先用浓度最高的混合标准溶液测定ATT值（告诉仪器最高浓度是多少，测完之后用纯水洗一下），然后依次测定不同浓度混合标准溶液中各元素的发射强度，测量结束后，仪器自动绘出标准曲线。

4、发样的测定

用与标准系列同样方法测定光强度，然后从标准曲线上查出发样中各元素含量。

若某种元素浓度超过最高浓度限值，要进行稀释。

【结果及公式】

以c为横坐标，原子发射谱线强度（

）为纵坐标，根据样品中各元素的

从标曲中得到其浓度cx

【注意事项】

器皿等玻璃器材不要随意放置，以免污染。

进样：

样品→毛细管→雾化器雾化→雾化室进一步雾化→炬管→光学系统

紫外分光光度法测定蛋白质的含量

【实验原理】

蛋白质分子结构中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，具有吸收紫外光的性质，其最大吸收波长为280nm左右。

在一定实验条件下，蛋白质溶液的吸光度与其浓度符合Lambert–Beer定律，据此可对蛋白质进行定量分析。

结构：

光源→单色器→吸收池→检测器→显示系统

注：

此次试验用紫外光，所以选用石英比色杯。

Q或者S表示石英的意思，放置时字母要朝同一个方向。

比色杯为成对的，不能混用。

【实验步骤】

1.吸收光谱曲线的绘制：

以生理盐水作参比，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，从200～400nm扫描任一牛血清白蛋白标准液的吸收曲线并找出最大吸收波长（λmax）。

2.标准曲线的绘制：

移取5.00mg/ml牛血清白蛋白标准应用液0.00、0.50、1.00、1.50和2.00ml，分别置于10ml比色管中，用生理盐水稀释至刻度，摇匀。

以生理盐水作参比，在λmax波长下测定吸光度，以溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

3.未知蛋白质溶液的测定：

准确移取血清样本0.1ml，置于10ml比色管中，定容至刻度。

以生理盐水作参比，在λmax波长下测定吸光度。

【实验结果】

Cx=C×稀释倍数

其中Cx为待测蛋白质溶液的质量浓度；

C为由标准曲线确定的被测溶液蛋白质的质量浓度

【注意事项】

1.由于蛋白质的紫外吸收峰常因溶液pH的改变而改变，测定时未知溶液与标准溶液的pH要一致。

2.紫外分光光度法测定蛋白质的准确度较差，其主要原因为不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量不同，使得不同蛋白质溶液在280nm的吸光系数也不同。

样品中若含有核酸，可分别测定在280nm和260nm的吸光度值，用经验校正公式计算蛋白质的浓度。

蛋白质浓度=1.45×A280－0.74×A260（mg/mL）

【仪器电脑操作】

仪器连接自检→光谱扫描（设置200～400nm高速扫描）→方法设置（选择λmax，多点，固定波长，改单位）→进行测定（输入号码和浓度，记录吸光度值）

荧光分析法测定尿中核黄素（VB2）含量

【实验原理】

核黄素（VB2）在一定波长的光波照射下发荧光。

在PH6~7的溶液中荧光最强，在其他条件恒定时，荧光强度F与VB2浓度C成正比，即F=KC；当PH>11时荧光消失。

尿中共存物质干扰VB2的测定，需要将尿液通过硅镁吸附柱，使其中VB2被硅镁吸附柱吸附，再用洗脱液洗脱，测定洗脱液中VB2的荧光强度。

采用标准曲线法进行测量。

光源（氙弧灯200~800nm；高压汞灯卤钨灯一般用于荧光计）→分光系统（两个单色器，第一单色器在光栅和样品池之间用于选择发射波长；第二单色器位于样品池和检测器之间与激发光源成90°以消除透过光影响，选择荧光波长）→样品池→检测器→显示系统

注：

比色皿四面光滑

【实验步骤】

1、装柱脱脂棉塞住吸附柱下端→硅镁吸附剂与蒸馏水混合装柱（约占柱长的2/3左右）→用双蒸水测试流速，控制流速在60~80滴/分，柱内应无气泡。

2、标准曲线的的绘制

标准液配制（0.5mg/L）：

取25mg/L的标储液1ml于50ml棕色容量瓶，定容混匀。

（1）吸附：

取VB2标准应用液0.00,0.50,1.00,1.50,2.00,2.50ml，分别过柱，用15~20ml热水（60~70℃）淋洗柱子（去除共存杂质）。

（2）洗脱：

将10ml比色管接在柱子下方，每个吸附柱中加入5ml洗脱液（洗脱VB2），待流尽后再用不足5ml的蒸馏水淋洗柱子，流出液一并盛入比色管中，双蒸水定容至10ml。

混匀，避光保存。

（3）测定：

取任意标准管溶液，固定荧光波长535nm，在350~500nm的波长范围内，测定不同激发光波长下的荧光强度，以激发光的波长为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制激发光谱，选择激发光波长（λex）。

固定激发波长λex，在450~600nm的波长范围内，测定不同荧光波长下的荧光强度，以荧光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制荧光光谱，选择荧光光波长（λem）。

在固定λex和λem的条件下，分别测定不同浓度标准溶液洗脱液中VB2的荧光强度，以VB2的浓度C为横坐标，相对荧光强度

为纵坐标，挥之标准曲线。

注：

洗脱液（丙酮：

冰醋酸：

超纯水=5:

2:

9）

3、测定样品

取尿样5ml，通过吸附柱进行吸附（VB2和杂质都会被吸附，热水将杂质洗脱，VB2易溶于有机溶剂，被保留在吸附柱上）、洗脱（洗脱液洗脱VB2）和荧光测定。

【电脑操作】

打开荧光光度计电源预热30min→打开操作软件→采集模式选光谱模式→λex（激发波长为横坐标，荧光强度为纵坐标）→λem（以荧光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标）→改为定量模式→输入λex，λem→测定

【实验结果及处理】

公式：

尿中VB2含量（mg/L）=样品管中VB2浓度×10÷取尿量

【注意事项】

1、操作应在避光下进行。

2、装住时要与水混装，以免柱内形成气泡和空隙。

3、测定前用洗脱液通过硅镁吸附柱，检查是否有荧光物质，有则用丙酮清洗烘干待用

石墨炉原子吸收法测定样品中铅的含量

【实验原理】

样品用基体改进剂稀释后直接注入石墨管中，通过程序升温将样品灰化及原子化。

在λ=283.3nm条件下测定铅基态原子蒸汽的吸光度，在一定实验条件下，其吸光度与溶液中铅的浓度呈正比，即A=Kc，据此进行定量分析。

组成：

铅元素灯共振线→石墨炉中原子→分光系统

水循环系统防止石墨管氧化，高纯氩气保护石墨管

原子化过程：

干燥、灰化、原子化、净化

【实验步骤】

1、血清样品处理

用微量移液管吸取血清100μg置于1.5ml的塑料离心管中，加入0.9ml的纯水（稀释10倍），在漩涡混合器上充分震摇均匀。

2、仪器工作条件

λ=283.3nm，灯电流为13mA，狭缝宽度为0.4nm，氘灯背景矫正，氩气流量0.6L/min。

石墨炉工作条件使用仪器推荐条件（因本次试验不使用基体改进剂，灰化温度应改为550℃）。

进样体积20μl，读数方式为峰面积。

3、工作曲线的绘制

将100μg/ml的铅储备液逐级稀释1000倍至100μg/L的铅标准溶液放入自动进样器，用稀释液稀释（机器自动稀释）到10、20、30、40μg/L，以稀释液为标准空白，依次进样测定，得到工作曲线。

4、样品测定

按仪器测定条件测定血清样品和试剂空白。

【实验结果】

【注意事项】

1、铅标准应用液的配制应采用逐级稀释法，以减小误差。

（1ml→10ml→1ml→10ml→1ml→10ml）

2、铅是高温下易挥发元素，在不使用基体改进剂时，灰化温度不能超过600℃。

【仪器操作】

1、开机预热→光源开关打开→接通氩气→打开电脑系统（xxx32xxA？

？

）→将元素灯点亮（预热15min~30min）→背景校正（看AA，BG值是否正常）→建立方法（newmethod）→设置（settings）测量次数、温度→自动采样量、设置采样位置→标准系列（方程选择回归线性过零点，看单位，设置标准系列稀释浓度及储备液位置）

2、设置样品信息→设置样品位置、样品身份（血清）、体积

3、看看灯的稳定性（预热时间不够，寿命等影响稳定性）

4、石墨炉设置→手动校准自动进样器→自动检查→清洁石墨炉

5、检测→稀释剂的纯水放在1号位→铅的标准品2号→血清样品3号

电化学实验

实验一溶出伏安法测定水中铅含量

【实验原理】

当在工作电极上加上一定电位进行预电解时，待测样品中的铅还原富集在电极上并与电极上的汞生成汞齐，然后施加反向扫描电压，此时汞齐中的铅便氧化溶出，其氧化电流与待测样品中的铅浓度成正比，因此可作定量分析。

【实验步骤】

1.打开LK2006A型电化学分析系统，选择“线性扫描溶出伏安法”，设置镀汞实验。

参数:

灵敏度　10μA/V；起始电位0.000V；滤波参数　10Hz；电沉积电位-1.000V；放大倍率　1；扫描速度　100mV/s；平衡时间　10s；电沉积时间　30s电位增量　1mV；终止点位0.00V

2.将玻璃电极作工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂电极作对极，连接到LK2006A型电化学系统，并确认电化学主机与微机系统的连接正常。

3.取30.0ml镀汞液与50ml烧杯中，插入三电极系统，接镀汞实验参数设定，镀汞，检查汞膜完好，即可测定样品，记录峰电流值h1。

4.取30ml待测样品于烧杯中。

选择“方波溶出伏安法”，设定样品测定的实验条件参数:

灵敏度　10μA/V　；起始电位-0.100V　；方波周期　40ms

滤波参数　10Hz　；　电沉积电位-1.000V　　；方波幅度　20mV

放大倍率　1　；　电位增量　4mV　　；平衡时间　10s；电沉积时间　30s终止电位0.00V

5.在待测样品中加入5ml铅标准溶液按上述步骤进行测定，记下峰电流值h2。

【结果计算】

根据公式：

Cx=h1×Cs×Vs/h2（Vx+Vs）-h1×Vx

5、讨论

本次实验过程中出现了一个错误：

待测液和铅标准溶液的加样顺序搞混了，即在30ml的铅标准溶液中加入了5ml的待测溶液，故我们的实验结果可能存在误差。

实验二酸度计测水溶液PH

【实验原理】

酸度计主要是由参比电极（银-氯化银电极）、测量电极（玻璃电极）和精密电位计三部分组成。

银-氯化银电极由金属银、氯化银和饱和氯化钾溶液组成，电极电位不随溶液的PH变化而变化，在一定温度下和浓度下是一个定值。

在25℃时为0.2V。

玻璃电极：

电极电位会随溶液的PH变化而变化。

主要部分头部的玻璃球泡，是由特殊的敏感玻璃膜构成。

玻璃膜对氢离子敏感，浸入被测溶液时，被测溶液的氢离子与电极玻璃球泡表面水化层进行离子交换，玻璃球泡内层也同样产生电极电势。

由于内层氢离子浓度不变，外层氢离子浓度变化，因此内外层的电势差在变化，所以该电极电势随待测液的PH值不同而改变。

离子选择性电极电位与待测离子呈能斯特响应。

K值包括内参比电极电位和难于测量和计算的液接电位，因此要用已知PH的标准缓冲液（与被测溶液PH接近）进行校正，减小由液接电位和不对称电位带来的误差。

【注意事项】

1.使用前浸泡于蒸馏水或缓冲溶液中活化玻璃膜表面

2.玻璃电极的使用范围：

pH=1~9

3.避免碰碎或擦伤玻璃膜

4．不能测含F-的溶液和具有脱水性的溶液

5．复合pH电极需浸泡在KCl溶液中

6．电极浸入溶液需足够的平衡稳定时间

7．间隔中用蒸馏水浸泡，以稳定其不对称电位，用已知pH值的标准缓冲溶液进行定位校正可消除不对称电位的影响

8、读取PH时，还要读取温度！

★离子选择性电极电位有两部分组成，一个是内参比电极电位，一个是膜电位。

当玻璃膜与待测溶液接触之后，就会由于玻璃膜相和待测溶液相的氢离子浓度的不同进行离子交换，经过一段时间达到平衡，就产生了两个相间电位，其差值就是膜电位。

电极电位与待测溶液中氢离子离子呈能斯特响应。

实验三电导率的测定

【实验原理】

电解质具有导电能力，并遵循欧姆定律

在一定条件下，一定浓度的电解质溶液的电阻与电极间的距离成正比，与电极截面积成反比

电导是衡量电解质溶液导电能力的物理量，是电阻的倒数

（其中k为电导率：

两电极板为1

，距离1m的平行电极板之间电解质溶液的电导）与电解质溶液的浓度有关。

【注意事项】

1、电导率仪要预热30min才能进行电导率的测定。

2、测定前用纯水清洗电导电极。

高效液相色谱法（HPLC）测定饮料中山梨酸和苯甲酸

【实验方法与原理】

苯甲酸和山梨酸广泛用于食品防腐剂，能够引起人的再生障碍性贫血，粒状白细胞缺乏等。

因此国家严格限制其使用量。

在本实验中，样品首先经过超声和加热除去二氧化碳和乙醇，然后过滤注入高效液相色谱仪，经反相C18液相色谱柱分离后，紫外检测器230nm波长处检测。

以色谱峰的保留时间定性，色谱峰面积在一定范围内与浓度呈线性关系进行定量分析。

【实验步骤】

1、样品处理

碳酸饮料（雪碧）：

吸取10ml碳酸溶液超声5min（脱气），然后用微孔滤膜（0.22μm）过滤，滤液备用。

吸取100μl滤液于离心管中，并加入900μl超纯水（稀释了10倍），混合均匀标记为样品。

2、配制标准溶液

（1）取一定量的苯甲酸储备液，经滤膜过滤于离心管中。

吸取滤液50μl于另一离心管并加入950μl超纯水，得到50μg/ml的苯甲酸标准品，做好标记。

（2）同理得到50μg/ml的山梨酸标准品，做好标记。

（3）混合标准品配制：

分别吸取500μl过滤后的苯甲酸和山梨酸储备液于离心管中混合均匀，得到500μg/ml的混合标准品。

吸取50μl混合标准品（500μg/ml）于离心管中并加入950μl超纯水，得到25μg/ml的混合样，标记为混标。

3、色谱条件：

色谱柱：

C18反相键合色谱柱

流动相：

甲醇-0.02mol/L醋酸铵溶液（5:

95）

流速：

1ml/min检测波长：

230nm进样量10μl

4、标准品和样品测定

（1）分别进苯甲酸（50μg/ml）、山梨酸（50μg/ml）标准品，确定保留时间。

（2）记录混合标准品（25μg/ml）的峰面积并按下式计算样品中苯甲酸和山梨酸含量：

（3）测样品中的待测物质，根据保留时间确定苯甲酸，山梨酸的峰面积。

计算方法：

Cx=F×Cs×Ax÷As

式中：

Cx—为样品中被测物的含量（μg/ml）；Cs—为苯甲酸或山梨酸标准品的含量（μg/ml）。

F—为稀释倍数；Ax—样品的峰面积；As—标准品的峰面积。

【仪器操作】

平衡柱子→标准样测试（样品名、进样模式-标准样、方法-建立好的方法、位置-样品放置的位置、进样量、时间）→inject进样

【注意事项】

1、如果被测溶液含有气泡，对测定和仪器的使用均有影响，因此需要将被测溶液超声加热除去二氧化碳。

同时试验中所用的所有试剂均需脱气处理。

2、苯甲酸的灵敏波长为230nm，山梨酸的灵敏波长为254nm，在此波长测定时苯甲酸的灵敏度较低。

因此波长选择230nm。

3、平衡前用甲醇：

水（5:

95）冲洗柱子15min，再用甲醇-0.02mol/L醋酸铵溶液（5:

95）进行平衡。

4、开机顺序：

高压输液系统、进样系统、柱温箱、检测器、电脑软件。

5、使用盐做流动相的时候：

水：

甲醇=95:

5冲洗柱子20min以上；然后用甲醇冲洗色谱柱20min以上，保存色谱柱。

6、关机：

清洗结束后，点击并将泵流量输入为0，等压力降为0时，关掉泵电源，退出Breeze工作站，再关闭仪器各部分电源及计算机。

GC-MS（气相色谱与质谱联用仪）法测定N-亚硝胺类化合物

【实验原理】

利用色谱对混合物的高分离能力和质谱对化合物的而准确鉴定能力，可以对N-亚硝胺类化合物进行定性定量分析。

气相色谱的流动相为惰性气体，气固色谱法中以表面积大且具有一定活性的吸附剂作为固定相。

当多组分混合样品进入色谱柱后，由于吸附剂对每个组分的吸附能力不同，经一段时间后，各组分在色谱柱中运行速度不同，吸附能力弱的组分容易被解吸下来，最先离开色谱柱进入检测器。

因此各组分可以在色谱柱中彼此分离，顺序进入检测器，记录下来。

质谱分析是通过被测样品离子的质荷比的测定进行分析的一种方法。

被分析的样品首先要离子化，然后利用不同离子在电场或磁场的运动行为的不同，把离子按质荷比分开而得到的质谱，通过样品的质谱和相关信息，可以得到样品的定性，定量结果。

【知识点】

1、原理:

利用组分在两相中分配系数不同进行分离

2、载气：

惰性，

3、•检测器：

火焰离子化，电子捕获、火焰光度、氮磷、热导

•FID：

氢气与带样载气混合，引入空气，火线点火，形成氢焰，将组分离子化，在外加电场作用下，产生离子流，经信号放大，由色谱工作站记录。

•氢气：

空气：

载气=1:

10:

1

•检测器的温度要大于100℃——为了防止水在离子室冷凝，降低灵敏度

•NPD:

对环境污染物中痕量N、P化合物具有高选择性

•检测器温度>进样口温度>柱箱温度

4、分离条件的选择

载气流速：

最佳载气流速（此时塔板高最大，柱效最高）

柱温：

样品进样后迅速气化，气化室温度大于组分沸点

程序升温：

保证各组分都能与固定相充分接触（注意：

柱温要低于固定相的沸点）

GC-定量（内标法）

MS-确定结构，定性-全扫描（根据出峰时间定性）-sim（离子检测）定量（外/内标，选择合适的特征离子进行定量）

开始时间设为3min，使溶剂都出去再进行质谱扫描。

【注意事项】

1、仪器保持良好的真空度-保证定量的准确度

2、防止离子源被污染

3、实验前进行柱子老化处理

4、二氯甲烷容易挥发，要及时盖好试管塞

打开气瓶-气相部分-质谱部分

软件操作：

抽真空→设定气相色谱条件→质谱条件