1031 郝祥祥 环境介质中多环芳烃的测定研究.docx
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1031郝祥祥环境介质中多环芳烃的测定研究
环境介质中多环芳烃的测定研究
学生姓名：
郝祥祥导师姓名：
高凡张秀蓝
摘要建立了大气、土壤、沉积物和水体中16种多环芳烃（PAHs）的高效液相色谱（HPLC）紫外/荧光检测法。
16种PAHs中二氢苊无荧光吸收，不适宜荧光检测，因此为了达到16种化合物同时检测需要紫外和荧光检测器串联。
当大气采样700L/min,连续采样24h，大气样品方法检出限为0.0002ng/m3—0.045ng/m3，各目标物空白加标回收率为79%—120%（萘为203%，空白较高），RSD<16%；当土壤/沉积物取样2.0g，方法检出限为0.106µg/kg—25µg/kg，各目标物空白加标回收率为88%—139%（萘为199%，空白较高），RSD<14%；水样取样2.0L，方法检出限为0.0003µg/L—0.083µg/L，各目标物空白加标回收率为76%—128%（萘为197%，空白较高），RSD<17%。
通过对实际样品的分析检测，验证了本方法的实用性。
利用建立的实验室高效液相色谱法与气相色谱—质谱法进行比较，从而论证了测定多环芳烃时这两种方法能够互相替代。
关键词多环芳烃；土壤；沉积物；大气；水样；高效液相色谱
DeterminationOfPolycyclicAromaticHydrocarbonsInEnvironmentalMedia
Nameofstudent:
HAOXiang-xiangNameoftutor:
ZhangXiu-lanGAOFan
AbstractThehighperformanceliquidchromatography（HPLC）withUV/fluorescencedetectorwasdevelopedtodeterminate16PAHsingas,soil,sedimentandwater.Acenaphthenein16PAHsdoesnotabsorbfluorescenceandisnotsuitableforfluorescencedetection.SoweneedcascadeUVandfluorescencedetectorsinordertodetect16compoundsatthesametime.Whensampledair700L/minandkept24h,themethoddetectionlimitwas0.0002ng/m3—0.045ng/m3,theblankrecoveriesforthetargetcompoundswasintherangeof79%-120%（Naphthaleneis203%）,RSD<16%;Whensampledsoilorsediment2.0g,themethoddetectionlimitwas0.106µg/kg—25µg/kg,theblankrecoveriesforthetargetcompoundswasintherangeof88%-139%（Naphthaleneis199%）,RSD<14%;Whensampledwater2.0L,themethoddetectionlimitwas0.0003µg/L—0.083µg/L,theblankrecoveriesforthetargetcompoundswasintherangeof76%-128%（Naphthaleneis197%）,RSD<17%.Inthisstudy,therealsamplesweredetectedtoverifythepracticalityofthismethod.Comparewithgaschromatography（GC）–MSmethodtodemonstratethetwomethodscouldreplaceeachother.
KeywordsPAHs;soil;sediment;gas;watersamples;HPLC
摘要
ABSTRACT
目录
一、前言1
1.1多环芳烃概述1
1.2多环芳烃检测方法及研究进展2
1.3本文的研究目的和意义4
二、PAH的分析方法5
2.1前处理过程5
2.1.1采样6
2.1.2萃取6
2.1.3旋蒸浓缩7
2.1.4小柱净化7
2.1.5氮吹定容7
2.2仪器分析7
2.2.1气相色谱—质谱法7
2.2.2高效液相色谱法9
2.3耗材与设备12
2.3.1主要试剂和耗材12
2.3.2仪器设备12
三、实验室液相分析方法的建立13
3.1仪器分析条件的建立和优化13
3.2前处理条件的探索15
3.2.1溶剂转化15
3.2.2净化柱的选择16
3.2.3淋洗曲线18
3.2.4前处理过程目标物的损失19
3.2.5空白21
3.3加标回收23
3.3.1水样23
3.3.2大气25
3.3.3土壤/沉积物26
3.4实际样品的检测28
四、HPLC与GC-MS的对比29
4.1液相需要更严格的净化过程29
4.2损失率30
4.3线性范围30
五、结论32
一、前言
1.1多环芳烃概述
多环芳烃（PolycyclicAromaticHydrocarbons,简称PAHs）是指分子中含有两个或两个以上苯环的碳氢化合物，其中苯环是以线状、角状或簇状排列的稠环化合物[]。
PAHs惰性较强、性质稳定，具有持久性致癌、致畸、致突变作用，是最早被发现的环境污染物之一,目前已经发现的致癌性多环芳烃及其衍生物超过400种[]～[]。
1976年美国环保局（EPA）提出的129中“优先污染物”中，多环芳烃类化合物有16种；2005年欧盟发布的《关于多环芳香烃的指令》（PAHs指令2005/69/EC）限制包含苯并芘在内的16种PAHs的使用，这16种PAHs有萘、苊、二氢苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并（a）蒽、屈、苯并（b）荧蒽、苯并（k）荧蒽、苯并（a）芘、茚苯（1,2,3-cd）芘、二苯并（ah）蒽和苯并（g.h.i）苝[]。
1990年我国提出的68种水体“优先控制污染物”有7种属于多环芳烃，分别为：
荧蒽（FLU）、苯并（b）荧蒽（BbF）、苯并（k）荧蒽（BkF）、苯并（a）芘（BaP）、苯并（g.h.i）苝（Bper）、茚并（1,2,3,-cd）芘（IP）和萘（NPH）[]。
人们对环境介质中PAHs的关注越来越多，主要原因有如下几方面：
1、它们种类繁多，其总数在几千种以上；2、分布范围广，在空气、水体、土壤中都有它们的存在；3、与人类的日常生活关系密切。
广泛存在于食物，饮用水，装饰材料等人们日常接触的物质中；4、保留时间长。
多数多环芳烃类化合物很难被降解，因此在环境中能存在很长时间；5、很多种类的多环芳烃具有致癌活性；6、能在不同介质间相互迁移转化[]。
多环芳烃的来源分为天然源和人为源两类。
PAHs的天然源包括燃烧（森林大火和火山喷发）和生物合成（沉积物成岩过程、生物转化过程和焦油矿坑内气体），由于森林大火和火山喷发具有偶然性且发生概率低，而生物合成缓慢微量且生物圈有一定的自净能力，因此天然来源所占比例并不高；人为源包括化学工业污染源、交通运输污染源、生活污染源等[]。
这里的化工污染指大部分生产多环芳烃或者以多环芳烃为中间产物工厂企业，违规排污对环境造成影响最终危及到人类正常生活。
现在大部分化工企业都建在距离生活区很近的地方，排出的多环芳烃通过各种方式影响人类健康；交通运输污染：
目前的交通工具基本全靠燃烧石油提供动力，由于技术等各种限制因素，石油不能完全燃烧就产生了大量的多环芳烃。
汽车、船、飞机等通过尾气将多环芳烃排放到大气，水，土壤等环境介质中，通过生物富集进入人体，对人体健康造成危害；生活污染源：
这是多环芳烃人为来源所占比例最高的部分。
燃烧煤和木材取暖做饭，田间秸秆焚烧，私有车内的PAHs，路边的烧烤，甚至人们每天使用最多的塑料制品也含有多环芳烃，虽然看不着摸不到，但多环芳烃与人们的生活息息相关。
其中，交通污染来源和生活污染来源占了人为来源很大比例，是环境中PAHs的主要来源[]。
多环芳烃在环境中大多数是以吸附态和乳化态形式存在，一旦进入环境，便受到自然界各种固有过程的影响，发生变迁。
通过复杂的物理迁移、化学及生物转化反应，在大气、水体、土壤、生物体等系统中不断变化，改变分布状况，因此PAHs广泛并能稳定分布于自然环境中，对人类健康和生态环境有很大的潜在危害[]。
PAHs由于其毒性、生物蓄积性和半挥发性能在环境中持久存在,而被列入典型持久性有机污染物（POPs）,受到国际上科学界的广泛关注[]。
1.2多环芳烃检测方法及研究进展
随着科学技术的进步，经过几十年的发展，多环芳烃的测定方法更加趋于成熟。
从目视比色法和薄层分析法，到荧光分光光度法，再到后来的气相色谱-质谱法（GC-MC）、高效液相色谱（HPLC）-荧光/紫外检测法，对多环芳烃各化合物的检测更加精确。
1、GB/T5009.27—1985（1996，2003）《食品中苯并（a）芘的测定方法》[]
GB/T5009.27—2003用目视比色法测定食品中PAHs的含量。
目视比色法：
将样品净化后与苯并（a）芘标准液滴于同一条乙酰化滤纸上，再用展开剂展开，阴干后暗室365nm波长紫外灯下目测与标准斑点比较，概略定量。
此方法快速简便，适用于大规模普查筛选，但只是一种概略定量法，准确度和精密度不高[]。
2、GB11895—89《水质苯并苯并（a）芘的测定乙酰化滤纸层析荧光分光光度法》
荧光分光光度法：
提取样品净化后在乙酰化滤纸上分离苯并（a）芘，因苯并（a）芘在紫外光照射下呈蓝紫色荧光斑点，将分离后有苯并（a）芘的滤纸部分剪下，用溶剂浸出后，用荧光分光光度计测荧光强度与标准比较定量。
此方法使用范围较窄，荧光分析法灵敏度高所以干扰因素多，溶剂不纯会带来较大误差。
而且这两种方法在实验过程中需要用到乙酸酐试剂制作乙酰化滤纸，乙酸酐试剂为易制毒药品，购买手续繁琐不易获得[]。
3、GBT13198-91《水质六种特定多环芳烃的测定高效液相色谱法》
本标准适用于饮用水、地下水、湖库水、河水及焦化厂和油毡厂的工业污水中荧蒽、苯并（b）荧蒽、苯并（k）荧蒽、苯并（a）芘、苯并（g.h.i）苝、茚并（1,2,3,-cd）芘六种多环芳烃的测定。
原理：
使用环己烷通过液液萃取法提取水中多环芳烃，提取液通过弗罗里硅土柱，多环芳烃吸附在柱上，用丙酮加二氯甲烷混合溶液脱附PAHs后，用配备荧光或紫外检测器的高效液相色谱仪测定。
水样中若存在可被共萃取的能产生荧光信号或熄灭荧光的物质对本法有干扰[]。
4、气质联用的标准方法：
GB/T26411—2010（2012）《海水中16种多环芳烃的测定气相色谱—质谱法》、HJ646—2013《环境空气和废气气相和颗粒物中多环芳烃的测定气相色谱—质谱法》、《土壤和沉积物多环芳烃的测定气相色谱—质谱法》（征求意见稿）
GB/T26411—2010适用于海水、地表水和地下水中16种多环芳烃的测定。
原理：
采用C18固相萃取柱直接富集水中16种多环芳烃，用丙酮和二氯甲烷洗脱，洗脱液经浓缩后，用正己烷定容，用气相色谱—质谱法定性定量分析[]。
HJ646—2013适用于环境空气、固定污染源排气和无组织排放空气中气相和颗粒物中16种多环芳烃的测定。
原理：
气相和颗粒物中多环芳烃分别收集于采样筒与玻璃纤维滤膜，采样筒和滤膜用10/90（V/V）乙醚/正己烷的混合溶剂提取，提取液经浓缩、硅胶柱或弗罗里柱等方式净化后上机检测，根据保留时间、质谱图或特征例子进行定性，内标法定量[]。
《土壤和沉积物多环芳烃的测定气相色谱—质谱法》（征求意见稿）适用于土壤和沉积物中多环芳烃的测定。
目标化合物选择国内外普遍关注的16种多环芳烃。
采用合适的萃取方法萃取，提取液用硅胶柱、硅酸镁（弗罗里柱）柱或GPC（凝胶色谱）等不同净化方法去除干扰物，浓缩后加入内标进气相色谱/质谱（GC/MS）定性定量分析。
5．液相色谱法的完善：
HJ478—2009《水质多环芳烃的测定液液萃取和固相萃取高效液相色谱法》、HJ647—2013《环境空气和废气气相和颗粒物中多环芳烃的测定高效液相色谱法》、《土壤和沉积物多环芳烃的测定高效液相色谱法》（征求意见稿）
HJ478—2009适用于饮用水、地下水、地表水、海水、工业废水及生活污水中多环芳烃的测定。
对水样采用液液萃取或者固相萃取，将萃取剂浓缩后，用具有荧光/紫外检测器的高效液相色谱仪分离检测[]。
HJ647—2013适用于环境空气、固定污染源排气和无组织排放空气中气相和颗粒物中16种多环芳烃的测定。
原理：
气相和颗粒物中多环芳烃分别收集于采样筒与玻璃纤维滤膜，采样筒和滤膜用10/90（V/V）乙醚/正己烷的混合溶剂提取，提取液经浓缩、硅胶柱或弗罗里柱等方式净化后用具有荧光/紫外检测器的高效液相色谱仪分离检测[]。
《土壤和沉积物多环芳烃的测定高效液相色谱法》（征求意见稿）适用于土壤和沉积物中16种多环芳烃的测定。
通过采样，萃取，净化等前处理过程，浓缩后进高效液相色谱仪定性定量分析。
气相色谱法（GC）作为一种成熟的色谱技术广泛的应用于PAHs的测定。
气相色谱法可以使复杂组分较好的分离，尤其对于小分子量的PAHs能达到很高的灵敏度和分离效果，与质谱联用可同时进行定性和定量分析。
由于质谱分析仪器的价格过高，对于大批量样品的研究不够经济，其使用受到限制[]。
气相色谱-质谱联用法（GC-MS）较气相色谱法（GC）有较大的改善。
GC-MS利用了GC的高分离能力和质谱的高灵敏、高鉴别能力，其方法检出限较低。
但是气相色谱法（GC）和气相色谱-质谱联用法（GC-MS）都存在样品分析温度太高，组分分离不尽理想，背景干扰较多等问题。
高效液相色谱和气相色谱之间的重大差别在于流动相的液体与气体之间的性质的差别[]。
用高效液相色谱法（HPLC）分离PAHs比气相色谱法（GC）具有以下优点：
高效液相色谱法（HPLC）分析样品时不需要将样品气化，特别是高效液相色谱与荧光检测器联用，对PAHs这类含荧光特性物质具有很高的选择性和灵敏度；工作温度低（<80℃），对被分离的各组分可以完整地收集，然后再进一步用紫外和荧光光谱分析，对某些PAHs的测定具有较高的分辨率和灵敏度，检出限低，定性准确度较高，另外仪器成本较低。
其缺点有：
对低环数的化合物荧光响应低，或无响应，溶剂消耗量较大。
1.3本文的研究目的和意义
气相色谱-质谱法（GC-MC）使用较早，方法比较成熟且能够满足检测的基本需要，质谱仪选择特征离子模式（SIM），定性更准确；高效液相色谱法（HPLC）起步较晚，在分离效果上远不及GC-MC，紫外检测器谱广性强但干扰较大，荧光检测器选择性强定性准确，但低环数响应较低。
通过对多环芳烃检测方法的研究发现，新兴的高效液相色谱法（HPLC）达不到更替老牌的气相色谱-质谱法（GC-MC）要求，但为何能够发展到与其并驾齐驱且隐隐有超越的趋势？
结合本实验室现有条件，本实验室已有成熟的气相色谱-质谱法测多环芳烃的方法，尚未建立健全实验室高效液相色谱法测定环境介质中多环芳烃的方法。
所以本文通过综合比较近年来多环芳烃的分析方法，对水样使用液液萃取，对大气、土壤和沉积物采用快速溶剂萃取（ASE）的前处理方法，经过浓缩、净化、定容、上机等一系列的空白加标、基质加标QA/QC实验，对样品分别采用气相色谱-质谱法（GC-MC）、高效液相色谱-荧光/紫外检测法两种方法进行分析。
通过实验计算，得到精密度、准确度、方法的检出限、定量限等性能参数，旨在比较气相色谱-质谱法、高效液相色谱两种分析检测方法并对两种方法的性能做出评价，对现有的液相检测方法进行完善，建立新的实验室多环芳烃测定方法。
二、PAH的分析方法
2.1前处理过程
纵观PAHs国家标准检测方法发展历程，从最初气相色谱-质谱法更替荧光分光光度法和目视比色法后成为主流检测方法，到现阶段高效液相色谱法的大力发展，我们可以看这两种方法的异同。
以测定大气中多环芳烃为例，现有方法包括HJ647—2013《环境空气和废气气相和颗粒物中多环芳烃的测定高效液相色谱法》和HJ646—2013《环境空气和废气气相和颗粒物中多环芳烃的测定气相色谱—质谱法》。
比较这两种方法，首先从相同点来看，这两个方法均适用于环境空气、固定污染源排气和无组织排放空气中气相和颗粒物中16种多环芳烃的测定。
16种多环芳烃包括萘、苊、二氢苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并（a）蒽、屈、苯并（b）荧蒽、苯并（k）荧蒽、苯并（a）芘、茚苯（1,2,3-cd）芘、二苯并（ah）蒽和苯并（g.h.i）苝[16]～[18]。
其次，从前处理过程进行比较：
前处理步骤：
2.1.1采样
1、水样采集：
使用1L或2L的具磨口塞的棕色玻璃细口瓶采集水样，样品采集到预先使用有机溶剂洗净干燥的采样瓶中，采样前不能用水样预洗采样瓶，以防止样品的沾染和吸附。
采样瓶要完全注满，不能留气泡。
样品采集后应避光于4℃以下冷藏，在7天内萃取。
2、大气样品采集：
大气采样所使用仪器是HV-1000F/700F型大流量空气采样器，用处理过的石英纤维滤膜和聚氨酯泡沫以700L/min24h连续采样富集多环芳烃。
石英纤维滤膜采集大气颗粒物中多环芳烃，聚氨酯泡沫采集气态中的多环芳烃。
将采样后的石英纤维滤膜和聚氨酯泡沫用铝箔包好贴标签放入冰箱冷藏。
3、土样/沉积物样品采集：
参照《土壤环境监测技术规范》（HJ/T166-2004）的有关要求采集有代表性的土壤或沉积物样品，保存在事先清洗洁净，并用有机溶剂处理不存在干扰物的磨口棕色玻璃瓶中。
运输过程中应密封避光，冷藏保存，途中避免干扰引入或样品破坏，尽快运回实验室。
冷冻干燥后，将样品研磨过60-80目筛，充分混匀后装入棕色品中待测。
如暂不能分析，应于4℃以下冷藏保存，保存时间为10d[]。
2.1.2萃取
1、水样：
使用液液萃取法，取水样2L于2L的分液漏斗中，先加入60gNaCl（去乳）。
再加入50mL二氯甲烷，充分震荡10min，使PAHs在水和二氯甲烷两相中达到平衡，静置出现分层现象，二氯甲烷比重较大分布在下层，由分液漏斗下部放出，过无水硫酸钠除水合并有机相。
重复上述操作三次。
2、大气：
测定大气颗粒物中多环芳烃时将采样的石英纤维滤膜折叠放入ASE萃取池萃取；测定大气气体中多环芳烃时将聚氨酯泡沫塞入ASE萃取池萃取。
萃取剂DCM：
HeX=1:
1，加热温度100℃，系统压强1500psi，循环3次。
3、土壤/沉积物：
准确称取2g样品（精确到小数点后三位），1g铜粉，2g硅藻土混合均匀后放入ASE萃取池。
DCM：
HeX=1:
1，加热温度100℃，系统压强1500psi，循环3次。
铜粉用于除去沉积物中的硫，加硅藻土是利用硅藻土特殊的多孔结构，和样品混匀可以增加与萃取剂的接触面积，使能够萃取充分。
2.1.3旋蒸浓缩
萃取体系为正己烷/二氯甲烷：
由于二氯甲烷和正己烷沸点不同，两种试剂混合旋蒸时，为防止爆沸，需逐渐降低压力，在25℃-30℃下，550hPa二氯甲烷首先被蒸发去除，当萃取溶剂体积逐渐减少，直至二分之一体积的试剂，萃取液中正己烷比例逐渐增加此时需降低真空度至260hPa，将正己烷尽量浓缩。
萃取体系为二氯甲烷：
水样中的PAHs分析时，萃取液为单一的二氯甲烷，在25℃-30℃下，二氯甲烷在真空度600hPa时开始浓缩。
2.1.4小柱净化
实验室PAHs净化柱通常包括弗罗里硅土柱和硅胶柱。
弗罗里硅土柱是一种高选择性的吸附柱，主要有三种成分组成：
二氧化硅（84%）、氧化镁（15.5）、硫酸钠（0.5%）。
吸附型填料，平均粒度：
40-60μm，80-100μm，平均孔径：
80Å，比表面：
91m2/g。
硅胶柱主要成分二氧化硅，平均孔径：
51Å，比表面：
519m2/g。
硅胶柱净化过程：
4mLHex活化+样品+2×2mLHex洗液+8mL20%DCM/Hex。
弗罗里硅土柱净化过程：
10mL20%DCM/Hex，10mLHex活化＋样品＋2×2mLHex洗液+12mL20%DCM/Hex。
2.1.5氮吹定容
1、用GC-MS测定：
转换正己烷溶剂，氮吹至1-2ml加5mL正己烷继续浓缩（重复两次），定容至1mL待测；
2、用HPLC测定：
转换乙腈溶剂，氮吹至1-2ml加5mL乙腈继续浓缩（重复两次），定容至1mL待测。
2.2仪器分析
2.2.1气相色谱—质谱法
1、国家标准气相色谱—质谱法仪器条件：
进样口温度：
250℃；进样方式：
不分流进样，分流比60:
1。
程序升温：
70℃（保持2min，然后以10℃/min增加）→320℃（保持5.5min）；载气：
氦气，流量：
1.0mL/min。
进样量：
1.0uL。
质谱参考条件，离子源：
EI源；离子源温度：
230℃；离子化能量：
70eV；扫描方式：
全扫描或选择离子扫描（SIM）。
[16]
表1目标化合物、内标和替代物定性定量离子
序号
化合物名称
目标离子
辅助定性离子
化合物类型
定量内标
1
萘
128
129,127
目标化合物
内标1
2
苊烯
152
151,153
目标化合物
内标2
3
苊
154
153,152
目标化合物
内标2
4
芴
166
165,167
目标化合物
内标3
5
菲
178
179,176
目标化合物
内标3
6
蒽
178
179,176
目标化合物
内标3
7
荧蒽
202
101,203
目标化合物
内标3
8
芘
202
101,203
目标化合物
内标3
9
苯并（a）蒽
228
114,226,229
目标化合物
内标4
10
屈
228
114,226,229
目标化合物
内标4
11
苯并（b）荧蒽
252
126,253
目标化合物
内标5
12
苯并（k）荧蒽
252
126,253
目标化合物
内标5
13
苯并（a）芘
252
126,253
目标化合物
内标5
14
茚并（1.2.3-cd）芘
276
138,227
目标化合物
内标5
15
二苯并（a.h）蒽
278
139,279
目标化合物
内标5
16
苯并（g.h.i）芘
276
138,277
目标化合物
内标5
17
苯并（a）芘-D12
212
106,213
替代物2
内标5
18
荧蒽-D10
212
106,213
替代物2
内标3
19
2-氟联苯
172
171,173
替代物1
内标2
20
萘-D8
136
68,173
内标1
21
苊-D10
164
162
内标2
22
菲-D10
188
94
内标3
23
苝-D12
264
260,265
内标5
24
屈-D12
240
241,120
内标4
2、实验室气相色谱—质
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