香草酸Vanillicacid又称香荚兰酸.docx
《香草酸Vanillicacid又称香荚兰酸.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《香草酸Vanillicacid又称香荚兰酸.docx（8页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
香草酸Vanillicacid又称香荚兰酸
香草酸（Vanillicacid），又称香荚兰酸
第一章绪论
1.1产品概况
香草酸（Vanillicacid），又称香荚兰酸，化学名是:
4-羟基-3-甲氧基苯甲酸（4-Hydroxy-3-methoxybenzoicacid）,分子式为:
C8H8O4，分子量为168.15，结构式是:
香草醛（Vanillin），又称香兰素、香草素或香兰醛，化学名是:
3-甲氧基-4-羟基苯甲醛（3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde）,分子式为C8H8O3，分子量为152.15，结构式是:
香草醛是最重要的香味物质之一，广泛存在于自然界中，如在香荚兰豆、秘鲁香膏、苏合香膏、安息香膏、爪香毛油、丁香花蕾油、丁子香芽油和香子兰的荚中等许多精油及植物中均有发现。
1.1.1产品理化性质
香草酸常温下为黄色粉末，易溶于乙醇，微溶于醚和水，能升华，熔点208-210?
。
香草醛常温下为白色至微黄色针状结晶或结晶性粉末，易溶于乙醇、乙醚、氯仿、冰醋酸和热挥发油，熔点284-285?
，相对密度（d420）1.056;具有香兰豆特有的香气，易受光影响，在空气中逐渐氧化，遇碱或碱性物质易变色。
1.1.2香草醛用途及市场概况
香草醛是一种重要的香料，广泛应用于食品、饮料、化妆品、烟草工业中，在医药合成中是重要原料和中间体，它还可作为电镀液的添加剂、甘蔗的增产剂和催熟剂、杀虫药剂的引诱剂、除草剂、橡胶制品的除臭剂以及塑料制品的抗硬化剂等，其应用范围日益扩大，因此市场非常巨大。
1.1.2.1作为香料添加剂
在食品工业上，香兰素主要用于食品香精中，常用它调配奶油、巧克力、牛奶、酸乳酷、桃子、可可、菠萝、甜瓜、黄油、杏仁、朗姆酒、太纪、香蕉、樱桃、樱桃白兰地、草荣、胡桃、香草和醋栗等食品香精。
在糖果、口香糖、饼干、巧克力、冰洪淋和糕点等各种食品中均需添加香兰素。
在化妆香精中，用香兰素可配制日用化学品香精，用作化妆品的调香剂和定香剂。
香兰素及其衍生物如乙基香兰素、香草酸乙酯都是重要的合成香料。
香兰素与荣莉醛及所有的窃香香味能很好地调和，可作为香皂、牙膏、香水及各类化妆品中的加香调香剂，是制备化妆品、卫生品香料不可缺少的原料。
1.1.2.2在医药上的应用
香草醛具有一定的抗菌能力，已用于治疗皮肤病药物的配方中，在药物合成上，将邻位香草醛与硫酸二甲酯作用可生成藜芦醛，用于黄连素的合成;香草醛经溴化、水解和甲基化可制成3，4，5-三甲氧基苯甲醛，可用于磺胺增效剂TMP的重要中间体，在医药上，香草醛可用于赋香剂，具有浓烈的香子兰的特征气味，留香特别持久。
用香草醛还可以合成治疗高血压的药物L-甲基多巴，治疗上呼吸道感染和防治性病菌株传播的甲氧基氨基吡啶及治疗心脏病要罂粟碱等。
由香草醛合成的5-氯代汞香兰素、5-醋酸汞香兰素均具有杀菌作用，香草醛还可以作为核黄素（VB2）的增溶剂，是生产香豆素必不可少的原料，用香草醛还可以治疗因抽烟引起的口腔粗糙。
1
1.1.2.3市场概况
世界香兰素生产主要集中在法国、美国、意大利和中国。
目前世界上香兰素生产能力为17.4kt/a,我国香兰素生产能力为7.8kt/a,占世界香兰素生产能力的45%。
香兰素是世界上产量最大的合成香料，也是重要的有机合成原料。
国内外需求量很大，世界年需求量在10kt以上，国内需求量约1000t。
从目前来看，世界香兰素的生产能力过剩，但由于生产路线不同，成本相差很大，因此，产家间的竞争将会很激烈。
我国10多家香草醛生产企业都采用邻硝基氯化苯—邻氨基苯甲醚—愈刨木酚—香草醛的完整工艺，环境污染严重。
国内最大的香兰素产家是吉化集团公司，年产量为3000吨/年。
但国内生产效率低，生产技术、产品质量和价格都难以与世界先进水平竞争。
目前，绿色食品越来越受人们的欢迎，因此，生物法合成的天然香草醛的市场需求量越来越大，发展前景很好。
1.2本课题的研究意义
由于香草醛的应用广泛，需求量很大，目前市场上的天然香草醛供不应求，提高香草醛的产量非常重要。
本课题是利用微生物细胞生产天然的香草醛，既符合消费者追求天然产品的心理，又具有传统的化学合成和植物提取法不可比拟的优点:
有害物质含量低;生产周期短，不受季节影响;反应条件温和，在常温常压下进行。
本课题对游离的朱红密孔菌转化香草酸生成香草醛条件的优化，目的是提高香草醛的产量，以及研究朱红密孔菌的某些代谢机理。
由于催化香草酸生成香草醛的酶是香草醛脱氢酶，是一种氧化还原酶。
目前，国内外尚未报道对含有氧化还原酶的菌体进行固定化。
如果本课题能成功，在理论上具有重要的意义;在实际的生产应用中，可以使细胞反复利用，降低生产成本。
第二章游离细胞转化条件的研究
2.1材料与方法
2.1.1材料
2
2.1.1.1试剂
香草酸实验试剂西格马化学试剂公司
氢氧化钠优级纯中国医药集团上海化学试剂公司2-硫代巴比妥酸生化试剂中国医药集团上海化学试剂公司浓盐酸分析纯上海振兴化工二厂
无水乙醇分析纯上海振兴化工一厂
甲醇色谱纯江阴国达化学试剂厂
其余试剂市售。
2.1.1.2仪器设备
721可见分光光度仪上海华菁仪器有限公司
SHZ型循环水真空泵河南省巩义市站街光亚仪器厂81.2型磁力恒温搅拌器上海市县曹行无线电元件厂
高效液相色谱HP1100美国惠普公司
2.1.2菌种和培养方法
2.1.2.1菌种:
朱红密孔菌PycnoporuscinnabarinusSW-0203武汉大学菌种保藏中心2.1.2.1培养方法
（1）、斜面培养基:
马铃薯20%蛋白胨0.5%
琼脂2%KH2PO40.1%
葡萄糖2%MgSO4.7H2O0.05%
pH自然
30?
下培养7-10天，置冰箱保藏。
（2）、种子培养基
麦芽糖20g/L酒石酸二铵1.82g/L
酵母膏0.5g/LKH2PO40.2g/L
MgSO4.7H2O0.5g/LCaCl21.32mg/L
盐酸硫胺素2.5mg/L
pH自然
30?
，150r/min，48h，200mL/500mL，接种量10%。
（3）、发酵培养基
葡萄糖20g/L牛肉膏8g/L
KH2PO40.2g/LMgSO4.H2O0.5g/L
CaCl21.32mg/L盐酸硫胺素3.5mg/L
pH5.0
30?
，120r/min，48h，200mL/500mL，接种量10%。
培养基灭菌条件:
0.1MPa，20min
2.1.3分析方法
在比色管中，加5mL2:
1HCl,2mL10g/L2-硫代巴比妥酸溶液，再加0.5mL滤好的转化液，定容至10mL，以空白作对照，在55?
水浴反应10min，取出，在室温静置20min，于438nm下用1cm比色皿测其吸光度。
3
2.2结果与讨论
2.2.1香草醛标准曲线的绘制
吸光度0.0110.1120.2610.5230.7330.9971.294
香草醛浓度（g/L）0.010.10.20.40.60.812.2.2温度对转化的影响
用5%湿菌体含量、2g/L底物浓度、自然pH、100mL/250mL装液量在30?
、33?
、35?
、37?
下考察温度对产物浓度的影响，以24h时的产物浓度对温度作图，如下:
由图可见，35?
是转化的最适温度。
2.2.3湿菌体含量对转化的影响
在35?
、2g/L底物浓度、自然pH、100mL/250mL装液量下，1%、5%、10%、15%、20%湿菌体含量对产物浓度的影响。
10%是最适的转化湿菌体含量。
2.2.4pH对转化的影响
用HCl调底物的pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，在35?
、10%湿菌体含量、底物浓度为2g/L、装液量为100mL/250mL下测产物浓度，如下:
转化24h时的产物浓度随pH的变化曲线，说明pH4.0是最适pH，再选择缓冲体系。
2.2.5缓冲体系对转化的影响
选择柠檬酸-K2HPO4、柠檬酸-柠檬酸钠、NaAc-HAc、KH2PO4-H3PO4四种缓冲体系，以及细考虑pH3.5、pH4.5,在35?
、10%湿菌体含量、底物浓度为2g/L、装液量为50mL/150mL下测产物浓度，如下:
、
所以，不用缓冲体系的pH4.5是最适的pH。
2.2.6底物溶液的组成对转化的影响
用10%湿菌体含量、2g/L底物浓度、pH4.5、50mL/150mL装液量在35?
下，在底物溶液中添加葡萄糖、Na3PO4，看细胞是否需要补充能量。
方法是:
在第一批转化中，第二份加5g/L葡萄糖，第三份加5g/L葡萄糖和2g/LNa3PO4，第四份、第五份正常。
在第二批转化中，第二、四份加5g/L葡萄糖，第三、五份加5g/L葡萄糖和2g/LNa3PO4。
由图可见，加葡萄糖给反应体系补充能量，可以提高产物浓度。
说明5g/L葡萄糖可以提高转化率，使细胞能反复利用。
2.2.6诱导酶的证明
在朱红密孔菌发酵24h时加入0.3g/L、0.5g/L、1g/L的底物，在35?
、pH4.5、10%湿菌体含量、底物浓度为2g/L、装液量为50mL/150mL下测产物浓度，如下:
4
在转化12h时，加底物诱导的产物产量比不加底物诱导的高，说明该酶是诱导酶。
2.2.8诱导时间对转化的影响
在发酵培养基中加入1g/L的底物诱导，在35?
、pH4.0、10%湿菌体含量、5g/L葡萄糖、底物浓度为2g/L、装液量为50mL/150mL下测产物浓度，如下:
说明诱导12h是最佳的诱导时间。
2.2.9底物浓度对转化的影响
用1g/L、2g/L、3g/L、4g/L的底物浓度，在35?
、10%湿菌体含量、pH4.5、5g/L葡萄糖、装液量为50mL/150mL下测产物浓度，如下:
可见，2g/L是最适底物浓度，当增大底物浓度时，由于香草酸对细胞具有一定的毒害作用，反而，抑制反应的进行。
如何提高底物浓度有待进一步探讨。
2.2.10单纯反复利用与活化反复利用
用不加葡萄糖单纯反复利用、加葡萄糖活化反复利用、维持pH4.5不变,在35?
、10%湿菌体含量、2g/L的底物浓度、pH4.5、装液量为100mL/250mL下测产物浓度，如下:
可见，加葡萄糖并在反应过程中流加盐酸，维持反应体系pH不变，有利于反应的进行。
2.2.11转化反应时间曲线
用HPLC测定35?
、10%湿菌体含量、pH4.5、底物浓度为2g/L、5g/L葡萄糖、装液量为100mL/250mL时的底物浓度和产物浓度，如下:
2.3本章小结
本章对游离的朱红密孔菌转化香草酸生成香草醛条件的优化，通过研究温度、湿菌体含量、pH、缓冲体系、底物溶液的组成、底物浓度、诱导时间和诱导浓度对转化的影响，发现用1g/L的底物溶液诱导过菌体在35?
、10%湿菌体含量、pH4.5、底物浓度为2g/L、5g/L葡萄糖、装液量为100mL/250mL的条件下转化，产物浓度最高，为g/L。
第三章固定化细胞的初步研究
3.1材料与方法
5
3.1.1材料
卡拉胶、海藻酸钠、明胶、戊二醛，江苏省微生物研究所提供，其余试剂市售。
3.1.2固定化细胞的制备方法
（1）、卡拉胶包埋法:
将卡拉胶配制成一定浓度的生理盐水溶液，煮沸溶解，冷却至58?
左右，与生理盐水
升级会员 