PGM测序方法protocol.docx
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PGM测序方法protocol
314芯片测序方法
文库构建：
PCR扩增基因组DNA的目标区域
1.选择下方合适的表格是基于用户选择的是2x的引物池还是5x的引物池。
对每一个DNA和引物池的混合，将以下组分加入PCR管内。
以下表格提供了包含和未包含IonAmpliSeq?
SampleIDPanel的反应体系。
对多个反应可准备配置混合溶液。
2X引物池（Cat.nos.4477685,4477686,andcustompanels）
成分
不包含IDpanel（ul）
包含IDpanel（ul）
5XIonAmpliSeq?
HiFiMix
4
4
2XIonAmpliSeq?
PrimerPool
10
10
可选:
20XIonAmpliSeq?
SampleIDPanel
--
1
gDNA,10ng
Y
Y
Nuclease-freeWater
6-Y
5-Y
总体积
20
20
5X引物池（Cat.nos.4471262and4475346）
成分
不包含IDpanel（ul）
包含IDpanel（ul）
5XIonAmpliSeq?
HiFiMix
4
4
5XIonAmpliSeq?
PrimerPool
4
4
可选:
20XIonAmpliSeq?
SampleIDPanel
--
1
gDNA,10ng
Y
Y
Nuclease-freeWater
12-Y
11-Y
总体积
20
20
2.充分震荡，简单离心。
3.将PCR管置于PCR仪内，运行一下程序以扩增基因组上目标区域。
阶段
步骤
温度
时间
持续
酶活化
99℃
2分钟
循环数（根据下表格设置）
变性
99℃
15秒
退火/延伸
60℃
4/8/16*分钟
持续
--
10℃
持续+
*4分钟是对≤1536对引物池；8分钟是对1537-6144对引物池；16分钟是对6145-24576对引物池。
+PCR产物可置于10℃过夜储存。
引物对数目
循环数
标准DNA
石蜡包埋DNA
12-24
21
24
25-48
20
23
49-96
19
22
97-192
18
21
193-384
17
20
385-768
16
19
769-1536
15
18
1537-3072
14
17
3073-6144
13
16
6145-12288
12
15
12289-24576
11
14
注意：
Ready‐to‐usepanels:
当加入IonAmpliSeq?
SampleIDpanel时不需要调整循环数。
Customprimerpools：
如果一个custom设计的panel中包含两个引物池，并分别落在不同的循环数分类中，请选用更大的循环数来扩增这两个引物池。
一般标准样品可以增加一个循环，从而保证其扩增效率，石蜡切片样品可增加2-3个循环。
如果引物池有两管及以上，应当分别扩增（10μl体系）。
扩增完后混合取20μl进行下轮实验。
暂停点–PCR产物可以储存在10°C过夜，需要更长时间储存，可以置于–20°C.
部分消化引物序列
1.轻度离心PCR管将反应后溶液收集到管底。
往每个混合反应液中加入2微升FuPa?
Reagent?
，总体系达到22微升。
2.充分振荡混匀，轻度离心将液体收集到管底。
（也可以选择用枪吸取一半以上的液体上下吹打至少5次来混匀）
3.将PCR管放入PCR仪，按以下程序运行。
温度
时间
50℃
10分钟
55℃
10分钟
60℃
20分钟
10℃
持续（最长至1小时）
将接头连接至扩增产物并纯化
配置并运行连接反应
1.如果有可见的沉淀物在Switch溶液中，通过室温下震荡或上下吹吸来溶解并重悬。
2.小心PCR管加入以下成分到每个反应孔内消化样本。
在加入之前可先混合Switch溶液和接头。
成分
体积（μL）
SwitchSolution
4
稀释的barcode接头混合物
2
总体积
28
3.在每个PCR管内加入2微升DNA连接酶。
4.充分振荡混匀，轻度离心将液体收集到管底。
（也可以选择用枪吸取一半以上的液体上下吹打至少5次来混匀）
5.将PCR管放入PCR仪，按以下程序运行。
温度
时间
22℃
30分钟
72℃
10分钟
10℃
持续（最长至1小时）
暂停点–产物可以置于–20°C保存。
纯化未扩增的文库
使用Agencourt?
AMPure?
XP试剂1.5x样本体积
重要事项!
–将AMPure?
?
XP?
reagent?
置于室温并充分振荡将磁珠混匀，使用时缓慢吸取.接下来的步骤需要使用新鲜配置的70%乙醇。
对每个样品，混合230微升无水乙醇和100微升无核酶水。
1.将加完接头的文库转移至1.5ml离心管内，加入45微升（1.5x样本体积）的Agencourt?
AMPure?
XP试剂。
用枪吹打5次使DNA与磁珠悬浮液充分混匀。
2.将混合液置于室温5分钟。
3.将1.5ml离心管置于DynaMag?
‐96?
Side?
Magnet?
（Cat.?
no.?
12331D）磁力架上，静置2分钟或者等溶液变清澈。
小心地吸走并弃掉上清，不要扰动磁珠。
4.向离心管中加入150μL新鲜配制的70%乙醇，在磁力上来回移动1.5ml离心管来洗涤磁珠，然后小心地弃去上清，不要扰动磁珠。
5.重复第4步，进行第二次洗涤。
6.确保乙醇液滴已全部从孔中吸走。
将1.5ml离心管放置于磁力架上，室温空气干燥5分钟，注意不要过度干燥。
7.将1.5ml离心管从磁力架上拿开，在每管中加入50μLLowTE充分浸润磁珠。
充分振荡混匀，轻度离心将液体收集到管底。
（也可以选择用枪吸取一半以上的液体上下吹打至少5次来混匀）
8.将1.5ml离心管置于磁力架上2分钟。
上清液中含有文库。
文库扩增：
1.将1.5mlEP管从磁力架上取下，加50μlPlatinum?
?
PCR?
SuperMix?
High?
Fidelity和2?
μlof?
Library?
Amplification?
Primer?
Mix。
Platinum?
PCRSuperMixHighFidelity和LibraryAmplificationPrimerMix需要事先混合好。
充分漩涡震荡后简单离心，或者用枪上下吹吸5次。
2.将1.5mlEP管放在磁力架上至少2分钟，将上清约50μl转移到一个干净的200μLPCR内。
3.运行一下PCR程序
纯化扩增后的文库
第一轮纯化
1.加入25μl（0.5X的样品体积）?
Agencourt?
?
AMPure?
?
XP?
Reagent到每个样品管中，用移液枪吹吸5次。
2.室温下静置5分钟。
3.将样品管放在磁力架上至少5分钟，直至溶液变澄清。
4.小心的将上清移入另一个干净的PCR管中。
第二轮纯化
1.在第一轮纯化取到的上清中加入60μlAgencourt?
?
AMPure?
?
XP?
Reagent，用枪头反复吹吸5次
2.室温下静置5分钟。
3.将样品管放在磁力架上至少3分钟，直至溶液变澄清，将上清吸除。
4.加入150μl新鲜配置的70%的酒精，缓慢旋转两圈，将上清吸除。
5.重复步骤4
6.确保酒精完全被移除，打开管盖，常温干燥5分钟。
7.将样品管从磁力架上取下，加入50μl?
LowTE，充分漩涡震荡，简单离心，或将移液枪调至40μl?
吹吸5次。
8.将样品管放入磁力架后，静置两分钟，将上清转移到新的1.5ml离心管。
Qubit定量
1.制备?
Qubit?
?
dsDNA?
HS?
reagent稀释液：
1μlQubit?
?
dsDNA?
HS?
reagent加199μl?
Qubit?
?
dsDNA?
HS?
Buffer。
2.在10μL?
的?
amplified?
Ion?
AmpliSeq?
?
library?
中加入190μL?
的dye?
reagent，混合充分后静置2分钟。
3.1μL样品中加入199μLdyereagent进行测样。
定量完成后，不同引物的相同样品的管合为一管（相同浓度）每管定到300PM，混合后能达到100PM。
IonPGM200bp自动模本制备
在IonOneTouch2instrument上制备模板ISP
1.4.1IonOneTouch2仪器准备
1.4.1.1打开IonOneTouch2背面的电源开关；按触摸屏上OPENLID，等待离心机盖打开；
1.4.1.2参照图1将RecoveryTubes（IonPGMTMTemplateOT2Supplies200）放置于IonOneTouch2离心收集器的转子中,随后将RecoveryRouters（IonPGMTMTemplateOT2Supplies200）放置于相应位置，手动盖上离心机盖；
图1
1.4.1.3参照图2顺序将IonOneTouch?
2AmplificationPlate（IonPGMTMTemplateOT2Supplies200）放置于加热模块中，将加热模块手柄压向自己身体方向，盖上IonOneTouch?
Lid，导管固定于上端的卡口和正面右上角的支架上，将AmplificationPlate的注射针垂直插入IonOneTouch?
DLInjectorHub，直至接触到底部的RecoveryRouter，然后松开注射针
图2
6
5
4c
4b
4a
3
1
2
1.4.1.4IonOneTouch?
Oil和IonPGMOT2RecoverySolution添加
1.4.1.4.1每次开始使用新的IonPGM?
TemplateOT2200Kit，丢弃掉前一个试剂盒使用的IonOneTouch?
Sipper和IonOneTouch?
Tubes，戴上新的乳胶手套，装上新的IonOneTouch?
Sipper；将IonOneTouch?
Oil瓶（IonPGMTMTemplateOT2Solutions200）上下颠倒10次，倒入任意一个新的IonOneTouch?
Tube中，约1/2满，安装至标示有
的下方相应位置拧紧；IonPGMOT2RecoverySolution（IonPGMTMTemplateOT2Solutions200）倒入另一个新的IonOneTouch?
Tube中，约1/3满，安装至标示有
的下方相应位置拧紧；
1.4.1.4.2同一个IonPGM?
TemplateOT2200Kit的后续使用准备时，将IonOneTouch?
Oil（IonPGMTMTemplateOT2Solutions200）瓶上下颠倒10次，取下有IonOneTouch?
Oil的IonOneTouch?
Tube，剧烈混匀至产生微小的气泡（图3），加入IonOneTouch?
Oil，约1/2满，安装至标示有
的下方相应位置拧紧；将IonPGMOT2RecoverySolution（IonPGMTMTemplateOT2Solutions200）倒入另一个的含有IonPGMOT2RecoverySolution的IonOneTouch?
Tube中，约1/3满，安装至标示有
的下方相应位置拧紧；
图3
1.4.2IonOneTouch反应液相准备及上机
1.4.2.1按照如下表格顺序室温配置体系，试剂来自IonPGMTMTemplateOT2Reagents200
顺序
试剂
管盖颜色
体积（ul）
处理方式及状态
1
Nuclease-FreeWater
——
25
——
2
IonPGM?
TemplateOT2200ReagentMix
紫色
500
提前室温放置，充分溶解至无沉淀，漩涡混合确保充分溶解,使用后剩余的保存于4℃
3
IonPGM?
TemplateOT2200PCRReagentB
蓝色
300
充分溶解至无沉淀，漩涡混合确保充分溶解,使用后剩余的保存于室温
4
IonPGM?
TemplateOT2200EnzymeMix
褐色
50
短暂离心后，冰上放置
5
测序用文库
——
25
将定量好的文库稀释至15ng/ml,取2ul稀释到25ul
——
Total
——
900
——
1.4.2.2将上述体系涡旋震荡5s，稍离心；
1.4.2.3将IonPGM?
TemplateOT2200IonSphere?
Particles最大速漩涡混匀1min，上下吸打5次上下吸打混匀，室温放置备用；
1IonPGMOneTouch?
PlusReactionFilter（IonPGMTMTemplateOT2Reactions200移液器将所有的液相缓慢从距离另外两个孔较远的样品孔（图4）注入reactionfilter，注意移液头与样品孔紧密接触插紧；
图4
1.4.2.5用1000ul移液器从此孔缓慢加入1000ulIonOneTouch?
ReactionOil（IonPGMTMTemplateOT2Solutions200），更换一个新的1000ulUniversalFitFilterTip移液头（防止交叉污染），再缓慢加入500ulIonOneTouch?
ReactionOil；
1.4.2.6如图5，将加样孔置于左侧，顺时针倒转reactionfilter，避免管内导管接触反应液相；
图5
1.4.2.7如图6，将reactionfilter插入IonOneTouch?
相应位置，边缘凸起位置朝向自己；
凸起部分
图6
1
图7
1.4.2.9选择IonPGMTMTemplateOT2200kit（图8）
图8
1xpert,最后点击NEXT开始运行。
1.4.3运行结束及IonOneTouch?
清洗
图9
1RecoveryRouter，小心缓慢将RecoveryTubes取出放于板架上，模板ISP位于RecoveryTubes底部外侧（图10）
图10
1.4.3.4拿掉ReactionFilter，将CleaningAdapter（IonPGMTMTemplateOT2Supplies200）凸出部分面向自己插入相应位置（图11）
图11
1
1
1AmplificationPlate和废液管一起扔进专门的垃圾桶，关闭电源
IonOneTouchTMES的操作及阳性模板富集
1.5.1沿远离沉淀一侧，自液面开始小心将两管RecoveryTubes中的上清液吸掉，各剩余约50uL；
1.5.2取一个新的1.5mL的Non-StickTube，将RecoveryTubes中剩余50uL液体吹打10次后吸入其中；
1.5.3在两管RecoveryTubes中各加入100uLWashSolution（IonOneTouch?
200SolutionsKitv2Non-StickTube中；
1.5.4在6.5.3的1.5mLNon-StickTubes中再加入1000uL200uLWashSolution，最大转速漩涡振荡10s混匀，15500g离心3min；
1.5.5沿远离沉淀一侧，自液面开始小心吸掉上清液，剩余100uL在管底，低速漩涡振荡10s混匀；
1.5.6配制好新鲜的1MNaOH（1MNaOH最长可在一周内使用）；
取一个1.5mL普通离心管，按如下表格配制Melt-OffSolution（每次新鲜配制）
顺序
试剂
体积（ul）
1
Tweensolution（IonPGMTMTemplateOT2Solutions200）
280
2
1MNaOH
40
Total
320
1.5.7吸取130uLMyOne?
BeadsWashSolution到一个新的1.5mL的Non-StickTube中；将Dynabeads?
MyOne?
StreptavidinC1Beads最大转速漩涡震荡30s，取13.0uL到上述1.5mL的Non-StickTube，漩涡振荡混匀30s，短暂离心2s；
1.5.8将6.5.7的离心管置于DynaMag?
-2magnet上2min或至溶液澄清，小心吸掉上清，避免碰触沉淀；将离心管从DynaMag?
-2magnet上取下，吸取130uLMyOne?
BeadsWashSolution到离心管中，漩涡振荡悬浮Dynabeads?
MyOne?
StreptavidinC1Beads；
圆头
方头
1.5.9取一个8-wellstrip（IonPGMTMTemplateOT2Supplies200），方头永远放在面朝自己的左面，从左到右依次编号为1到8（图12）；
图12
1.5.10按如下表格在8-wellstrip中加入相应试剂（IonPGMTMTemplateOT2Solutions200）
孔编号
对应孔试剂
1（方头第一个）
6.5.5中的100ul模板ISP（U）
2
6.5.8中130ulDynabeads?
MyOne?
StreptavidinC1Beads（B）
3
300uLIonOneTouch?
WashSolution（W）
4
300uLIonOneTouch?
WashSolution（W）
5
300uLIonOneTouch?
WashSolution（W）
6
空
7
吸取300uL6.5.6中新鲜配制的Melt-Offsolution（M）
8
空
1.5.11将8-wellstrip放入IonOneTouch?
ES前方白色模块中的凹槽中，方头在左，紧靠在凹槽右侧；
1.5.12取一个新的Tip（IonPGMTMTemplateOT2Supplies200）放入TipLoader
中，从支架上取下TipArm插入TipLoader中，用力向下按紧1s，松开，取下TipArm放回支架上（一定要放到位），新的Tip已装在TipArm下方（图13）；
图13
1.5.13在TipArm下方的洞中放一个开口的0.2ml的PCR管,里面加入NeutralizationSolution10ul（IonPGMTMTemplateOT2Solutions200）；
1.5.14打开IonOneTouch?
ES电源，按Start/Stop键，运行过程中显示屏上一直显示“run”，IonOneTouch?
ES自动开始阳性模板富集；
1.5.15富集过程结束是，IonOneTouch?
ES会有蜂鸣提示，并且显示屏显示“End”，整个过程约40min；
1.5.16结束后，将用过的Tip取下，和8-wellstrip一起扔进专门的垃圾桶，关闭电源
1.5.17取出0.2mLPCR管扣上盖子，15500g离心3min；
1.5.18沿远离沉淀一侧，从液面开始小心吸掉上清，剩余10uL在管底；
加入200uLIonOneTouch?
WashSolution，上下吹打混匀10次，15500g离心3min,沿远离沉淀一侧，从液面开始小心吸掉上清，剩余10uL在管底；
加入100uLIonOneTouch?
WashSolution，上下吹打混匀10次，若不立即进行后续的测序，可置于4℃保存2-3天。
IonPGM200bp读长上机测序操作
PGM的清洗
1.2.1氯片清洗（如果PGM超过48个小时未使用，请首先用氯片清洗）；
1.2.1.1将W1氯片清洗瓶用每次50ml18MΩ去离子水漂洗3次，备用；W1清洗瓶用每次50ml18MΩ去离子水漂洗3次后，加满250ml18MΩ去离子水，备用；
1.2.1.2将1L的容器用每次100ml18MΩ去离子水漂洗3次，装满1L18MΩ去离子水，放入一片PGMCleaningTablet（IonPGM?
SequencingSolutions200Kitv2），静置10min；
1.2.1.310min后，加入1ml1MNaOH,混匀（该溶液请在2-3小时之内使用）；
1.2.1.4用0.22μm滤器过滤250ml以上氯片溶液到W1氯片清洗瓶中；
打开PGM电源，氩气输出气压调至30psi；
1.2.1.6PGM启动完毕后，点击进入Clean菜单，确保芯片座上有一块旧芯片；
1.2.1.7按屏幕提示，勾选Chloritecleaning，点击NEXT；
1.2.1.8通过后按提示将W1氯片清洗瓶拧上W1位（保证有吸管）；
1.2.1.9将W2和W3清洗瓶拧上相应的位置保证有各自的空清洗瓶及吸管，清空废液瓶的废液；
1去掉前端四种dNTPs尖底管，不要取下吸管，在吸管下放置废液缸；
1按next，进入清洗程序；
1第一轮清洗结束后，用18MΩ去离子水涮洗W1位的吸管，将含250ml18MΩ去离子水的W1清洗瓶拧上W1位，按next进入第二轮清洗程序；
1第二轮清洗结束，整个PGM清洗结束，可进入初始化步骤；
1.2.218MΩ去离子水清洗（两次初始化之间小于24h）；
1.2.2.1W1清洗瓶用每次50ml18MΩ去离子水漂洗3次后，加满250ml18MΩ去离子水，备用；
1.2.2.2打开PGM电源，氩气输出气压调至30psi；
1.2.2.3PGM启动完毕后，点击进入Clean菜单，确保芯片座上有一块旧芯片；
1.2.2.4按屏幕提示，勾选18-MOhmwatercleaning，点击NEXT；
1.2.2.5通过后按提示将W1清洗瓶拧上W1位（保证有吸管）；
1.2.2.6将W2和W3清洗瓶拧上相应的位置保证有各自的空清洗瓶及吸管，清空废液瓶的废液；
1.2.2.7去掉前端四种dNTPs尖底管，不要取下吸管，在吸管下放置废液缸；
1.2.2.8按next，进入清洗程序，18MΩ去离子水清洗只进行一轮，结束后可以开始6.3PGM初始化。
PGM初始化
1.3.1将试剂盒中dNTPs（IonPGM?
SequencingReagents200Kitv2）取出，在冰上融化备用；
1.3.2将W2试剂瓶（IonPGM?
SequencingSupplies200Kitv2）用每次200ml18MΩ去离子水漂洗3次，在上部接线处用记号笔标记（见图1，如果有两条接缝线，标
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