柑橘皮化学成分分析实验报告DOC.docx
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柑橘皮化学成分分析实验报告DOC
综合化学实验
------柑橘皮化学成分分析报告
一、实验背景
1、柑橘皮营养价值
随着人类对营养、健康意识的增强和物质文明的迅速发展,使得食品向自然、粗糙、低热值、低盐、低脂肪、符合原物、方便等方向发展,整个社会对营养食品越来越关注。
关于柑桔果皮的营养价值与药用价值,国内外资料都有较详尽的介绍,尤其是近年来,美国、巴西、日本、中国等国科学家在柑桔果皮的营养及综合利用方面做了大量的研究,并取得了可喜成果。
柑橘皮是柑橘果实加工后余留的最大比例副产品,其内含丰富的生理活性成分以及磷、钙、铁、锌等微量元素。
其所含营养成分除氨基酸外,其余均高于果肉,尤其是富含具有一定生理活性成分如维生素C、类黄酮等物质,使柑橘皮及其提取物具有多重生理功效。
2、设计思路
掌握气相色谱法分离定量香精油
掌握溶剂回流法提取类黄酮
掌握水蒸气蒸馏法提取香精油
掌握紫外光谱法测定类黄酮含量
有效成分分析
有效成分提取
掌握原子吸收测定金属离子含量橙皮苷含量
3、实验目的
(1)掌握水溶剂浸渍法提取维生素C和微量元素。
(2)掌握醇类回流法提取类黄酮成分。
(3)掌握水蒸气蒸馏提取香精油成分。
(4)掌握碘量法测定维生素C含量。
(5)掌握原子吸收光谱测定金属离子。
(6)掌握紫外光谱法测定类黄酮含量。
(7)掌握建立GC混合物分离的色谱条件,并以外标法测定相关物质的含量。
二、实验原理
1、柑橘皮有效成分的提取
从天然产物中提取化学成分,常用的方法有溶剂提取法、水蒸气蒸馏法及升华法。
(1)溶剂提取法
溶剂提取法是实际工作中应用最普遍的方法,根据天然产物中各化学成分的溶解性能,选用对有效成分溶解度大而对其他成分溶解度小的溶剂,用适当的方法将有效成分尽可能完全地从药材组织中溶解出来。
溶剂提取法的基本原理是在渗透、扩散作用下,溶剂渗透入药材组织细胞内部,溶解可溶性物质,形成细胞内外溶质的浓度差而产生渗透压,在渗透压的作用下,细胞外的溶剂不断进入药材组织中,溶解可溶性成分,细胞内的浓溶液不断向外扩散,如此反复,直至细胞内外溶液浓度达到动态平衡即完成一次提取。
滤出此溶液,再加入新溶剂,使细胞内外产生新的浓度差,提取可继续进行,直至所需成分全部或大部分溶出。
溶剂提取法的关键是选择合适的溶剂,一种好的溶剂应对所提成分有较大的溶解度,而对共存杂质的溶解度很小。
良好溶剂的选择应遵循“相似相溶”的经验规律。
一般说来,只要溶剂的极性与化学成分的极性相似,化学成分就易被溶解。
按照溶剂极性大小顺序以及溶解性能不同,可将其分为水、亲水性有机溶剂、亲脂性有机溶剂三类:
水是强极性溶剂,对药材组织的穿透力大,中药中某些亲水性成分如糖类、蛋白质、氨基酸、鞣质、有机酸盐、生物碱盐、大多数苷类、无机盐等,都可以水为提取溶剂。
柑橘皮中维C和微量元素由于其很好的水溶性,故用水作溶剂提取。
亲水性有机溶剂 是指甲醇、乙醇、丙酮等极性较大且能与水相互混溶的有机溶剂,其中乙醇最为常用。
柑橘皮中的类黄酮物质在醇中有很好的溶解性,可用乙醇回流的方法提取。
亲脂性有机溶剂如石油醚、苯、乙醚、氯仿、醋酸乙酯等,此类溶剂的特点是极性小,与水不能混溶,具较强的选择性,只能提取亲脂性成分,如挥发油、油脂、叶绿素、树脂、某些游离生物碱及一些苷元等。
溶剂的选择要综合考虑溶剂的极性、被提取成分及共存的其他成分的性质三方面的因素来决定,同时还应兼顾考虑溶剂是否使用安全、价廉易得、浓缩方便等特点。
(2)水蒸气蒸馏
水蒸气蒸馏是用来分离和提纯液态或固态有机化合物的一种方法,常用于下列几种情况:
(1)某些沸点高的有机化合物,在常压下蒸馏虽可与副产品分离,但易被破坏;
(2)混合物中含有大量树脂状杂质或不挥发性杂质,采用蒸馏、萃取等方法都难于分离;(3)从较多固体反应物中分离出被吸附的液体。
使用水蒸气蒸馏这种分离方法是有条件限制的,被提纯物质必须具备以下几个条件:
(1)不溶或难溶于水;
(2)与沸水长时间共存而不发生化学反应;(3)在100℃左右必须具有一定的蒸气压(一般不小于1.33kPa)
柑橘香精油由柠檬烯,beta-蒎烯等纯碳氢烯烃和高级醇类,醛类,酮类,酯类组成的含氧化合物组成。
这些成分不溶于水,沸点较高,易被空气中的氧气氧化。
因此常用水蒸气蒸馏提取。
2、维生素C的测定原理
维生素C是可溶于水的无色结晶,是一种分子结构最简单的维生素。
维生素C有防治坏血病的功能,所以在医药上常把它叫做抗坏血酸。
维生素C在水溶液中易被氧化,在碱性条件下易分解,维生素C具有较强的还原性,在酸性条件下,可被2,6-二氯靛酚氧化。
其结构如下所示:
滴定法是维生素C含量测定最主要的方法,滴定法主要有2,6一二氯靛酚滴定法和碘量法。
本实验用碘量法。
碘的标定:
I2+2S2O32-→2I-+S4O62-
硫代硫酸钠的标定:
6H++IO3-+5I-→3I2+3H2O
I2+2S2O32-→2I-+S4O62-
以碘酸钾为基准物,在酸性条件下与过量的碘化钾反应生成I2与2S2O32-反应。
3、原子吸收光谱测定金属离子
柑橘皮中的微量金属元素主要有钾、钙、铁、锌等,这些金属离子的含量测定可以原子吸收光谱法测定。
待测的柑橘皮的提取液在空气-乙炔火焰中原子化,在光路中分别测定锌对特定波长谱线的吸收。
含量计算需要先建立各个金属的标准工作曲线。
4、紫外光谱测定黄酮类化合物
黄酮类化合物是一类具有C6一C3一C6结构的酚类化合物的总称,目前已从柑橘中鉴定出来的黄酮类化合物有6O余种,最常见的为橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素芸香苷等二氢黄酮类。
橙皮苷是目前柑橘属黄酮中最主要的研究对象,橙皮苷(又称陈皮苷或桔皮苷)为二氢黄酮苷类化合物,是橙皮素与葡萄糖和鼠李糖结合形成的苷类。
由于橙皮苷和Al(NO3)3溶液在80℃反应15min后能形成黄色络合物,通过波长扫描,可测其420nm有最大吸收,通过橙皮苷对照品的系列溶液得到工作曲线后,进行样品中橙皮苷含量的测定。
5、气相色谱测定香精油
柑橘皮中含有多种香精油,其中含量最大的4种香精油分别是:
柠檬烯,beta-蒎烯,芳樟醇,乙酸芳樟醇。
这四种成分沸点不高,受热基本稳定,可用GC进行含量测定。
成分
结构
沸点
柠檬烯
175~177℃
Beta-蒎烯
155~156℃
芳樟醇
193~194℃
乙酸芳樟酯
219~220℃
三、实验仪器与试剂
仪器:
滴定管(酸式、碱式)、移液管、碘量瓶、烧瓶、冷凝管、容量瓶、锥形瓶、铜壶、布氏漏斗、抽滤瓶、圆底烧瓶、研钵、循环水式多用真空泵、SpectAA220原子吸收光度计、UV-2501PC型紫外-可见分光光度计、气相色谱仪GC-2014C
试剂:
橘皮、乙醇(95%)、氯仿、碘酸钾、硫代硫酸钠、盐酸(2%)、硫酸(3M)、1426mg/LZn2+离子储备液、橙皮苷标准液等
四、实验步骤
1、维生素C提取及含量测定
(1)柑橘皮水溶性成分的提取:
新鲜柑橘皮50g称量,剪成20*20cm细条,加80mL2%的HCl,浸泡0.5小时,抽滤,再加50ml2%盐酸,浸泡0.5h,抽滤,再加50ml2%盐酸,浸泡0.5h,抽滤,合并三次滤液,定容到250mL,移取10mL保存用于原子吸收分析,剩余用于维生素C测定。
(2)维生素C的含量测定
a.Na2S2O3溶液的配制(0.01mol/L):
称取约0.7895g的硫代硫酸钠结晶固体于小烧杯内,加少量蒸馏水溶解,定容于250ml容量瓶中,转移到棕色瓶中备用。
b.I2溶液的配制(0.01mol/L)已配好。
c.碘酸钾标准溶液配制:
差量法准确称取碘酸钾0.1052g,放入碘量瓶中,加20ml水,3ml3ml/L的H2SO4和10ml的10%的KI,用蒸馏水稀释定容到250ml。
d.硫代硫酸钠溶液的标定:
用水冲洗碱式滴定管,再用少量硫代硫酸钠溶液润洗,然后加入硫代硫酸钠至0刻度以上,排气;用移液管移取KIO3标准溶液25.00mL,加入3mL3M的硫酸、10mL10%碘化钾溶液,用硫代硫酸钠滴定该碘酸钾溶液至浅黄色,加入2mL淀粉指示剂,滴定至无色且30s内不变色;重复三次上述操作并记录数据;
e.I2溶液的标定
用移液管移取25.00mL)I2溶液到碘量瓶中,用硫代硫酸钠滴定至浅黄色,加入2mL淀粉指示剂,滴定至无色;重复三次上述操作并记录数据;
f.用标定好的碘溶液滴定样品,将240ml的维C提取液倒至锥形瓶中,滴定前加入2mL淀粉指示剂,滴定至淡蓝色。
2、AAS测Zn2+
(1)标准溶液的配制:
称取0.2981g氧化锌基准物,用6mol/L的HCl定容至100ml,稀释100倍后,分别移取0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml、2.50ml上述溶液至编号为1-5的50mL容量瓶中,稀释定容后待用。
(2)工作曲线绘制及样品含量测量:
按浓度重低到高的顺序依次测定1-5号容量瓶中不同浓度标准液的的吸光度并记录数据绘制工作曲线。
标准液测定完毕后,取步骤1中所移取出的10.00mL维C提取液,用尼龙滤网抽滤该维C提取液,抽滤完成后测定其吸光度。
3、橙皮苷的提取和含量测定
(1)乙醇回流提取橙皮苷:
定量20g橘皮在80ml乙醇中回流2小时,过滤,用乙醇定容到100ml容量瓶中,备用。
(2)橙皮苷含量的测定:
储备液:
称取0.0989g橙皮苷配制橙皮苷标准液(2mg/ml),用0.1M氢氧化钠:
乙醇=50:
50,定容到50ml容量瓶中。
将储蓄液稀释5倍至0.4mg/ml。
标准曲线绘制:
分别精密量取0.50ml、1.00ml、2.00ml、3.0ml、4.0ml的橙皮苷标准储备溶液0.4mg/ml,用用0.1M氢氧化钠:
乙醇=50:
50定容到50ml容量瓶中。
用移液管准确移取0.25mL样品于50ml容量瓶中,用乙醇定容。
(3)将紫外-分光光度计开机预热、设置,将参比液放入比色皿中,调零。
自检,波长范围为225~400nm,扫描速度为快。
基线校准。
打开样品室盖,对移取编号为3的那瓶溶液进行测定,确定最大吸收波长为287.10nm、361.90nm,之后按浓度由低到高的顺序,依次测定五个标准品的吸光度并记录数据,最后测定样品的吸光度并记录。
用三号在200-700nm内确定最大波长。
在最大波长处分别测定吸光度值,以值(y)为横坐标、橙皮苷的含量(x,mg/m1)为纵坐标作线性回归,得标准曲线。
样品含量的测定:
样品液稀释100倍,在最大吸收波长处测定吸光度。
4、香精油的提取和分析
(1)水蒸气蒸馏提取橘皮香精油:
称取30g的柑橘皮,剪成细条状,进行水蒸气蒸馏,控制水蒸气蒸馏速度,蒸馏1.5h,收集100-150ml左右的馏出液,将馏出液转移到分液漏斗中,用30ml氯仿萃取一次后,水层继续用20ml氯仿萃取一次,合并两次氯仿溶液,加无水硫酸钠至溶液澄清,用氯仿定容到50ml容量瓶中。
(2)气相色谱测定香精油的含量:
先进行色谱条件优化选出最优条件在进行样品及标准液的测定,优化条件为:
①柱温:
恒温180℃保留10min;②柱温:
60℃,以30℃/min的速度升到180℃,保留0min;③柱温:
60℃,以10℃/min的速度升到180℃,保留0min;优化完成后,选择最优条件进行样品的测定,并记录数据。
柑橘皮中含量最大的4种香精油分别是:
柠檬烯,beta-蒎烯,芳樟醇,乙酸芳樟醇。
将上述4中对照品配成标准溶液在GC上分离得到对照品的色谱图,样品进样,按照外标法测定含量。
五、结果与讨论
1、维生素C含量分析及讨论
称取0.1052g碘酸钾,0.7895g硫代硫酸钠MKIO3=214
C=6*(mKIO3/MKIO3)/(V2-V1)
相对偏差=|平均值-测量值|/平均值
表一、标定硫代硫酸钠
KIO3称重(g)
硫代硫酸钠初刻度V1(ml)
末刻度V2(ml)
滴定体积(ml)
硫代硫酸钠浓度(mol/L)
平均值(mol/L)
相对偏差(%)
0.1052
0.00
22.50
22.50
0.1311
0.1310
0.076%
0.1052
0.00
22.52
22.52
0.1310
0%
0.1052
0.00
22.51
22.51
0.1310
0%
表二、标定碘溶液
碘溶液体积(ml)
硫代硫酸钠初刻度(ml)
末刻度(ml)
体积(ml)
碘溶液浓度(mol/L)
平均浓度(mol/L)
相对偏差(%)
25.00
0.00
18.52
18.52
0.04852
0.04848
0.08%
25.00
0.00
18.50
18.50
0.04857
0.02%
25.00
0.00
18.46
18.46
0.04836
0.25%
CI2=CNa2S2O3*V/20
相对偏差=|平均值-测量值|/平均值
碘溶液滴定Vc所用体积10.03mlMvc=176.13m(VC)=CI2*V*MVc=85.64mg
样品中VC含量=m(VC)/(样品)=85.64/50=1.7129(mg/g橘皮)
2、金属离子锌含量分析及讨论
样品浓度(mg/L)
0.467
0.934
1.401
1.868
2.335
吸光度
0.1363
0.2030
0.3097
0.3844
0.4377
待测液吸光度
0.1765
由上图,拟合直线方程为:
A=0.1679c+0.0590,则浓度c=(A-0.0590)/0.1679
所以样品中Zn2+含量为:
c=(0.1765-0.0590)/0.1679=0.6998(mg/L)
故T=C*V/m(样品)=0.6998*0.25/50=0.0035(mg/g橘皮)
3、橙皮苷含量分析及讨论
先用3号0.01584mg/ml的样品测紫外吸收光谱,可得,在λ=287.10nm时,Abs为0.3977,
在即最大吸收值,所以λmax=287.10nm。
测得的待测溶液如下图:
λmax=287.10nm
样品浓度(mg/ml)
0.00396
0.00792
0.01584
0.02376
0.03168
吸光度
0.1259
0.2268
0.3977
0.5945
0.7974
待测液吸光度
0.3744
由上图,样品吸光度为0.3743时,样品中橙皮苷的含量为:
c=(0.3744-0.0291)/24.012=0.0(mg/ml)
故T=C*V/m(样品)=0.0144*100*100/10=14.38(mg/g橘皮)
λ=361.9nm
样品浓度(mg/ml)
0.00396
0.00792
0.01584
0.02376
0.03168
吸光度
0.0637
0.1191
0.2384
0.3546
0.4715
待测液吸光度
0.2860
由上图,样品吸光度为0.3352时,橙皮苷含量为c=(0.2860-0.0041)/14.755=0.0191(mg/ml)
故T=C*V/m(样品)=0.0191*100*100/10=19.1(mg/g橘皮)
(4)香精油含量分析及讨论
条件一:
柱温恒温180℃,保留10分钟
有效组分未完全分离,此条件不适合
条件二:
柱温:
60℃,以30℃/min的速度升到180℃,保留0min;
样品分离,分离效果不理想,原因在于程序升温过快
条件三:
柱温:
60℃,以10℃/min的速度升到180℃,保留0min;
样品完全分离,且分离效果较好
由柠檬烯、β-蒎烯、乙酸芳樟酯、芳樟醇的沸点与极性可知,出峰顺序为:
β-蒎烯柠檬烯芳樟醇乙酸芳樟酯。
bbeta-蒎烯=mbeta-蒎烯/V=0.0462*(10/50/50)=1.848*10-4(g/ml)
b柠檬烯=m柠檬烯/V=0.0432*(10/50/50)=1.728*10-4(g/ml)
b芳樟醇=m芳樟醇/V=0.134*(10/50/50)=5.36*10-4(g/ml)
b乙酸芳樟醇=m乙酸芳樟醇/V=0.1672*(10/50/50)=6.688*10-4(g/ml)
提取的精油的GC-FID谱图
成分
β-蒎烯
柠檬烯
芳樟醇
乙酸芳樟酯
标准样峰面积
274914.438
1845531.000
649394.938
1292709.125
标准样浓度(mg/mL)
0.1848
0.1728
0.5396
0.6688
样品峰面积
102769.961
2364683.000
203083.938
36935.277
样品浓度(mg/mL)
0.069
0.2214
0.168
0.0191
橘皮中样品含量(mg/g橘皮)
0.115
0.369
0.28
0.318
六、实验结果
1.橘皮Zn离子的含量为0.6998*0.25/50=0.0035(mg/g橘皮)
2.橘皮中橙皮苷含量为0.0144*100*100/10=14.38(mg/g橘皮)
3.橘皮中维C含量为85.64/50=1.7129(mg/g橘皮)
4.橘皮中β-蒎烯含量为0.115mg(β-蒎烯)/g(橘皮)
5.橘皮中柠檬烯的含量为0.369mg(柠檬烯)/g(橘皮)
6.橘皮中芳樟醇的含量为0.28mg(芳樟醇)/g(橘皮)
7.橘皮中乙酸芳樟醇的含量为0.318mg(乙酸芳樟醇)/g(橘皮)
七、讨论与分析
(1)维生素C含量的滴定:
①由Na2S2O3浓度测定的相对平均偏差可见,其滴定实验结果精密度较高;
②由I2的测定结果及相对平均偏差可见,三次滴定结果相对于Na2S2O3浓度测定时偏大,原因可能由于终点判断不准确、读数不够精准等;
③提取维C过程中,因为是一次性实验,对实验结果有着不可忽略的误差影响,I2浓度测定以及Na2S2O3浓度测定的准确与否也会对实验结果产生影响。
④测定中用的是碘量法,该方法简单方便,但是碘易挥发,见光分解。
在配置碘溶液时,加入了KI,结合成I3-以防止其挥发,分解。
滴定时要控制好滴定速度,多摇动。
快达到终点时。
滴定速度一定要慢。
判断变色点要半分钟内不褪色。
(2)AAS测Zn2+:
①由工作曲线可见,R2=0.9976其线性拟合关系较好,基本符合要求;影响线性的原因主要来至溶液的配置过程,如移取液体、读数的准确程度,溶液是否摇匀以及测定时比色皿装液过程中手法所带来的影响等;
(3)橙皮苷的提取和含量测定:
A,由工作曲线可见,在最大波长(λmax=287.10nm)处,样品的吸光度值在所作曲线的线性浓度范围内,实验结果具有一定的代表性;
B,在非最大波长(λ=361.90nm)处,样品的吸光度值在所作曲线的线性浓度范围之外,说明在361.90nm波长处,提取液试样中存在其他一些可以在此波长范围很好被吸收的物质。
不同分子的原子团和原子,它的发射光谱和吸收光谱不同。
因此可以根据其光谱的特征和强度研究化合物的结构和测定其含量。
本实验中,橙皮苷对光的特征吸收波长在287.10nm处,所以当波长为361.90nm时,溶液中存在着对该波长具有特征吸收的物质。
C,实验采用紫外分光光度计,柑橘提取液中可能有很多物质在最大吸收波范围内重叠吸收,吸光度并不能准确的反映含量,但是如果采用液相色谱进行分析可以将其中的组分全部分离出来,并且通过图谱信息可以得到柑橘皮中橙皮苷的准确含量。
(4)香精油的提取和分析:
①水蒸气蒸馏时,馏出液的速度不能太快,否则馏出液中有效成分含量很少,得到的谱图峰不明显,给后面的分析带来困难;
②加大鲜橘皮的用量、减慢馏出液滴下速度可有效增加有效峰的强度;
③影响香精油产量的主要因素有:
柑橘皮的粉碎程度、水蒸气速率、溶液挥发以及萃取过程中的损失等。
因此在实验过程中可适当加大橘皮的粉碎程度,更有利于香精油被蒸出;加快水蒸气的通入量,增大香精油被提取的动力,但通气量也不宜过大,以免蒸出过多的水,为进一步萃取带来不便,进而影响产率。
(5)在配制Na2S2O3溶液时,要用煮沸后冷却的蒸馏水,这是因为水中含有氧气、二氧化碳和细菌他们会发生反应,反应过程如下:
Na2S2O3→Na2SO3+S↓S2O32-+CO2+H2O→HSO3-+HCO3-+S↓(微生物)
S2O32-+1/2O2→SO42-+S↓
此外,水中微量的Cu2+或Fe3+等也能促进Na2S2O3溶液分解。
因此配制Na2S2O3溶液时,需要用新煮沸(为了除去CO2和杀死细菌)并冷却了的纯水,加入少量Na2CO3,使溶液呈弱碱性,以抑制细菌生长。
而Na2S2O3溶液不宜加热,加热时会加速空气中的氧气氧化Na2S2O3。
。
④通常从柑橘果皮中提取香精油的方法有压榨法、浸提法、水蒸气蒸馏法、超临界流体萃取法。
本实验采用的是水蒸气蒸馏法提取柑橘皮中香精油的。
选择水中蒸馏提取香精油这种方法的优点是设备简单、成本低、产量大、水分子容易向果皮组织中渗透,水置换出香精油,使精油向水中扩散,在水蒸气作用下形成油水共沸物同时蒸出。
水蒸气起到“搅拌”作用。