C636DNV对白纹伊蚊的致病性及其与登革病毒Ⅱ型相互作用的研究.docx
《C636DNV对白纹伊蚊的致病性及其与登革病毒Ⅱ型相互作用的研究.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《C636DNV对白纹伊蚊的致病性及其与登革病毒Ⅱ型相互作用的研究.docx（149页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
C636DNV对白纹伊蚊的致病性及其与登革病毒Ⅱ型相互作用的研究
C636DNV对白纹伊蚊的致病性及其与登革病毒Ⅱ型相互作用的研究
Thepathogenioityofmosquitodensoviruses（C6／36DNV）andits
nteractionwithDenguevirustypeⅡinAedesa／bopictusName：
WeiWeiSupervisor：
JingqiangZhangSpeciality：
Biophysics
Abstract
AedesalbopictusC6／36celldensovirus（C6／36DNV），amosquitodensoviruses，isisolatedfromachronicallyinfectedAe．albopictusC6／36cell．ThevirusbelongstothegenusBrevidensovirusofthesubfamilyDensovirinaeinthefamilyParvoviridae．Itissingle—strandedlinearDNA
virus．Eachdensovirusvirionpackageseitheraplusoraminussingle—stranded1inearDNAchain．Thevirionsappearasicosahedralnon—envelopedparticleswithadiameterof18—26珊．Thesequenceanalysisandcompareshowedthatthenucleotideandcodedaminoacidsequenceof
C6／36DNVarehighlyhomologoustotheAa印NVgenome，butgenomicorganizationandsomerepeatingsequencesaremorecloselyrelatedtotheAaJDNV．C6／36DNVchronicallyinfectedtheC6／36cells，buttheinfectedcellspropagatenormallyandhavenotapparentdifferencefromthenormalInthispaper，weusedtheC6／36DNVtoinfectAo．adbopdctuslarvae．ItcouldcauseAe．albopictuslarvaedeath，andcouldrestrainthereproductionofDEN一2inmosquito．Therefore，thestudyofC6／36DNVas
apossiblebiologicalcontrolagentsuggestsadualcontrolmethodagainst
IIl
denguevirusintheprocessofdenguevirustransmission．Thisresearchhasnotbeenreportedbefore
（1），ThechronicallyC6／36DNV—infectedAe．albopictusC6／36cellwasusedtoinfectedAe．albopictusfirst—daylarvae，themortalityreached97．463％：
Ae．a]bopfctussixth—daylarvaewasinfectedbyC6／36DNVwith
highervirusdoseorlongertime．themortalityreached40．75％
（2），Aquantificationrealtimepolymerasechainreaction（qPCR）usingSYBRGreenassayforquantityofC6／36DNVgenomesinAe．albopfctuslarvaeandadultmosquitogotvirusdynamicchangecurvegraph，whichprovedthatC6／36DNVnotonlycancausedAe．albopictuslarvaedeath，butalsocanlurkedtheadultmosquitowhocanverticallytransmitC6／36DNVtonext
generationstably
（3），TheinteractionofC6／36DNVanddenguevirustypeIIinAe．albopictusmosquitowarestudied．First，denguevirustype11wasusedtoinfectedthechronicallyC6／36DNV-infectedAe．albopfctusmosquito
adult，Arealtimepolymerasechainreaction（qPCR）usingSYBRGreenassayforquantityofC6／36DNVgenomesbeforeandafterdenguevirustypeIIinfectedtheC6／36DNV—infectedmosquitoadult，foundthatthequantityofC6／36DNVafterinfectionwasleapedtoafewi02～i03timesmorethanitbeforeinfection
（3），Next，denguevirustype11wasusedtoinfectedthechronically
C6／36DNV—positiveandC6／36DNV—negativeAe．albopictusmosquitoadult．
1v
TheRNAofDenguevirustypeIIandAe．MbopjctusribosomalproteinL8wareextractedfrommosquito，thenreversetranscribedtocDNA，rpL8cDNAwasusedasinternalcontrolgeneforthefluorescencequantitativerealtimePCRdetectionofdengueviruseDNA，foundquantityofdenguegenomesofC6／36DNV—negativemosquitowashigherafewhundredtimesthan
chronicallyC6／36DNV-positivemosquito，TheassayshowedthatC6／36DNVlurkedAe．aJbopictuscanrestrainreproductionofdenguevirustypeIIinmosquito，andthatdenguevirustypeIIcangreatlystimulatereproductionofC6／36DNVlurkedinmosquitochronically
（5），PathologicalstudyforC6／36DNV-infectedmosquitowithelectronmicroscopyfoundthattherewerenuclearandcytoplasmicparacrystallinestructureininfectedfatbodycellafterinfected4days，butatthistime，therewerenoobviousdiseaseinotherlarvaltissues．Later，otherlarvaltissuessuchashypodermalcellsandmusclecellswerealsoinfected．Theinfectedtissuesweredamagedseriously，thenuclearmembraneisbroken，boththemitochondriaandtheendoplasmicreticulum
becamebiggerandhollow．Theinfectedcellbecamedisintegratedanddied．
ThepaperisdevotedtothestudyofpathogenicityofC6／36DNVforAo．a]bopictus,withtheaimofusingthisvirusasabiologicalcontrol
agent．
Keyword：
Pathogenicity'C6／36DNV；DenguevirustypeIIAe．albopictus．
V
魏伟06／36D1Ⅳ对白纹伊蚊的致病性及其与登革病毒Ⅱ型相互作用的研究中山大学博士学位论文
刖舌一、浓核病毒
l、分类及其分子生物学背景
浓核病毒（Densovirus或Densonucleosisvirus，简称DNV）是一种能感染无脊椎动物，并使其产生浓核症（Densonucleosisdisease）的病毒。
浓核病毒含单链（ss）线状DNA，病毒颗粒无囊膜，正二十面体对称，直径18～26nm。
此类病毒能够聚集于所感染的宿主细胞核中，成晶格状排列（胡远扬等，1991）。
染病细胞的细胞器破坏严重，线粒体空泡化，内质网扩张、退化，核膨胀进而破裂，最终导致细胞的死亡（胡远扬等，1991；黄远达等，1994：
刘文斌等，1998）。
浓核病毒属细小病毒科（Parvoviridae）的一个亚科。
细小病毒科的病毒是目前动物病毒中最小最简单的一类单链线状DNA病毒。
细小病毒易感染的宿主范围很广，包括脊椎动物和无脊椎动物。
感染脊椎动物及人类的细小病毒属于细小病毒亚科（Parvovirinae），包括5个属（genera）：
主要的有细小病毒属（Parvovirus），代表种为小鼠细小病毒（minutevirusofmice，MvM）；依赖病毒属（Dependovirus），代表种为腺联病毒2型（adeno—associatedvirus2，从V）；红细胞病毒属（Erythrovirus），代表种为人细小病毒B19（Siegleta1．，1985；朱其太和蔡锡平，1999；徐耀先等，1999）。
（2005年ICTV第八次报告）
感染无脊椎动物的病毒归于浓核病毒亚科（Pensovirinae）。
目前已发现的浓核病毒的基因组长度从4kb到6kb不等。
在病毒成熟过程中，部分病毒粒子包裹了正链（plus—strand）DNA，另一部分病毒粒子包裹了负链（minus—strand）DNA。
在提取病毒核酸时，正链和负链能自动形成双链DNA分子（Kellyeta1．，1977：
Franckieta1．，1991）。
根据基因组的结构和组成，浓核病毒亚科分成四个属：
浓核病毒属（Pensovirus）、相同病毒属（Iteravirus）和短浓核病毒属（Brevidensovirus）等。
（2005年ICI'V第八次报告）
浓核病毒属的代表病毒有鹿眼蛱蝶浓核病毒（orunoniacoeniaDensovirus，fcDNV）、大蜡螟浓核病毒（GalleriamellonellaDensovirus，GgDNV）和黑胸大蠊浓核病毒（eermlanetafuliginosaDensovirus，PflDNV）。
该属病毒基因
魏伟C6／361邶f对白纹伊蚊的致病性及其与登革病毒Ⅱ型相百作用的研究中山太学博士学位论文
组长度为5．5～6kb；包被正链的病毒粒子与包被负链的病毒粒子数量相等：
正链和负链上均存在编码序列；基因组的两个末端具有500bp左右的反向重复序列（invertedterminalrepeats，ITR）（Dumaseta1．，1992：
Tijsseneta1．，1994；郭海涛等，2000）。
相同病毒属以家蚕浓核病毒1（Bombyx肋打DNV—l，B／d）NV-1）为其代表。
病毒基因组长度为5．2kb；包被正链的病毒粒子与包被负链的病毒粒子数量相等；编码序列只存在其中一条链上；末端的ITR长约200碱基（Bandoeta1．，1987ab，1990）。
短浓核病毒属的代表种是蚊子的浓核病毒和虾的一种感染性真皮和造血坏死病毒等（InfectiousHypodermalandHematopoieticNecrosisVirus，IHHNV）（ShikeetaL，2000）。
2、蚊子的短浓核病毒蚊子浓核病毒是指在蚊子的幼虫，成虫或其培养细胞系中发现并分离的浓核
病毒，属于细小病毒科浓核病毒亚科短浓核病毒属。
目前发现并分离的蚊子浓核
病毒共有9株。
最早发现的蚊子浓核病毒是埃及伊蚊浓核病毒（Aedesaegyptidensovirus，简称AaeDNV）。
1973年由前苏联的科学家从一种实验室饲养的埃及伊蚊幼虫中分离得到。
它能感染并杀死埃及伊蚊幼虫和库蚊幼虫，对埃及伊蚊有很强的致病性。
幼虫染病后出现蜷曲、黑化等症状，早龄幼虫100％死亡，晚龄幼虫有一部分能够存活并发育成成虫。
在这些存活下来的蚊子中携有AaeDNV，并且病毒能垂直传播给下一代（Lebedevaeta1．，1973；Wardeta1．，2001b）。
白纹伊蚊浓核病毒（Aedesalbopictusdensovirus，简称AalDNV）是另外一株较早发现的蚊子浓核病毒。
它是从一种外观正常，无明显病变的白纹伊蚊C6／36培养细胞系中分离得到的（Boubliketa1．，1994：
Joussetet“．，1993）。
它能使埃及伊蚊致病。
跟AaeDNV相类似，AaIDNV也致早龄幼虫100％死亡，能垂直传播给下一代（Barreaueta1．，1996，1997）。
埃及伊蚊浓核病毒（AedesaegyptiDensoviruses，AaeDNV）和白纹伊蚊浓核病毒（AedesalbopictusDensoviruses，AalDNV，曾名月牙V）的基因序列已
2
巍伟06／36DNv对白纹伊蚊的致病性及其与登革病毒u型相互作用的研究中山大学博士学位论文
经测定，长度分别为4009和4126nt。
大部分（85％）病毒颗粒含负链DNA：
编码序列全部位于正链上，末端序列具有T型发夹结构（Afanasievefa1．，1991：
BoubliketaL，1994）。
AaeDNV和Aa／DNV的基因组在正链上有三个读码框（OpenReadingFrame，ORF）：
左ORF、中ORF和右ORF。
左ORF包含着整个中ORF，左ORF的3’末端与右ORF的5’末端重叠。
左ORF和中ORF分别编码非结构蛋白NSI和NS2，而右ORF编码病毒的衣壳蛋白VP。
AaeDNV在负链上还有一个读码框（负链ORF），但可能不编码任何蛋白。
这两种浓核病毒的基因组上存在着跟其它细小病毒相似的启动子。
AaeDNV的基因上可能存在着三个启动子：
p0．5、p7和p61，而AalDNV的基因上可能存在两个启动子：
p7．2和p60（Afanasieveta1．，1991：
BoublikotaL，1994）。
研究发现AaeDNV的p0．5启动予可能不具启动子功能，p7启动子调节了AaeDNV的非结构蛋白的基因表达，而p61启动子调节了结构蛋白基因的表达。
AaeDNV的NSI蛋白是病毒基因组复制和表达所需要的反式作用因子，它能提高病毒各种基因的表达量；结构蛋白VP能在不同位点断裂，从而生成小分子量的衣壳蛋白（Afanasieveta1．，1994：
Kimmicketa1．，1998：
Wardeta1．，2001b）。
这两种浓核病毒均能感染蚊子，并且具有很强的致病性。
蚊子是人和动物的一些流行病病原体的传播媒介，给人类社会带来极大危害。
一直以来，人们不断在寻求，并尝试了各种各样的防蚊方法，而这两种浓核病毒为防蚊提供了一种新的方法，即生物防治的方法。
近几年来，关于伊蚊短浓核病毒的分子生物学研究取得了一定的进展。
最近报道在尖音库蚊（Culexpipiens）的幼虫中发现了另一种浓核病毒（CulexpipiensDensovirus，CpDNV），然而这种病毒的特征反而更接近于JcDNV（Jousseteta1．，2000）。
还有其它一些蚊子浓核病毒先后从自然群体、实验室培养的自纹伊蚊及其细胞系、埃及伊蚊、微小按蚊中分离得到（Joussetela1．1993，0’Neillela1．1995，Kittayaponglela1．1999，Joussetela1．2000，Rwegoshora
ela1．2000）。
C6／36DNV是2002年由本实验室从一种外观正常的白纹伊蚊C6／36培养细胞中发现并分离到一株新的浓核病毒，命名为白纹伊蚊C6／36培养细胞浓核病毒
i‘伟C6／369NY对白纹伊蚊的致病性及其与登革病毒Ⅱ型相互作用的研究中山太学博士学位论之
（AedesalbopictusC6／36celldensovirus，简称C6／36DNV）。
病毒DNA总长为4094nt，正链上存在了3个主要的读码框（OpenReadingFrame，ORF）：
左ORF、中ORF和右ORF。
整个中ORF包含在左ORF中，左、右两ORF末端有部分重叠。
中间编码序列侧翼的5’和3’非编码末端长度分别为252和437nt。
这种基因组结构与AaeONV和AaJDNV很相似，但是，C6／36DNV负链上没有明显的读码框。
左ORF编码一个有793氨基酸的非结构蛋白Ns一1，脊椎动物细小病毒的NS一1蛋白已经被证明参与了病毒DNA复制、包装，衣壳蛋白的表达以及调节细胞毒素的活性，细胞癌变及编程性死亡等过程（Tratshineta』．，1984：
HermonatetaL，1984：
Rhode，1985b：
CotmoreandTattersall，1987，1988，1989：
Vanacker
andRommelaere，1995；Soleta1．，1999）。
在AaeDNV的病毒复制中，NS一1蛋白通过反式激活病毒启动子来提高病毒各种蛋白基因的表达（Afannasievetal．，1994．1999）。
因此推测C6／36DNV的NS-1蛋白也有类似的功能。
NSl蛋白上存在NTF一结合位点，并且具有解旋酶的活性，能共价结合复合型DNA的5’末端，拓展了病毒DNA末端区的空间构型，起始DNA的复制。
Ns一1蛋白能显著的延缓细胞生长，并有杀细胞作用，Ns一1对宿主细胞具有毒性。
C6／36DNV的中ORF编码非结构蛋白NS-2。
在浓核病毒中，NS-2蛋白的功能目前还不是很清楚。
有研究发现一些细小病毒的NS一2对宿主细胞也具有毒性，只是毒性很小，但它能够促进NS-I细胞毒性的作用（Legrandeta1．，1993；
Legendreeta1．，1992；Lieta1．，1990）。
C6／36DNV的右ORF编码两个结构蛋白VPl和VP2，其N端的GTKRKRE序列应该是C6／36DNv结构蛋白的核定位信号。
C6／36DNV的VPl结构蛋白分予量为40kDa，由右ORF直接编码；VP2结构蛋白大小为38kDa，由40kDa的衣壳蛋白在富含甘氨酸处断裂产生．这两种结构蛋白构成了C6／36DNV病毒的核衣壳。
测序分析发现，C6／36DNV在核苷酸序列和编码的氨基酸序列上与埃及伊蚊浓核病毒（AaeDNV）有很高的同源性，但在基因组结构和某些重复序列上更接近于AaJDNV（Cheneta1．，2003）。
该病毒目前被归类于细小病毒科浓核病毒亚科短浓核病毒属，是线性单链DNA病毒。
一部分病毒颗粒包裹了负链DNA，而另一部分病毒颗粒包裹了正链DNA（Kellyetal，1977）。
病毒的外观形态呈正二十面
4
魏伟C6／36DNV对白纹伊蚊的致病性厦其与登革病毒II型相互作用的研究中山走学博士学位论主
体，是一种直径为18--26nm的无囊膜颗粒。
重构该病毒三维结构，分辨率达到
15．6一A（theneta1．．2004）。
Kittayapong等根据301bp的病毒基因保守区序列，研究了泰国株蚊子浓核病毒（AthDNV）和其他蚊子的6种浓核病毒的亲源关系，发现AtII）NV和AaeDNV的亲缘关系最近，而和其他蚊子浓核病毒的亲缘关系较远（Kittayapongeta1．，1999）。
二、防蚊措施以及蚊媒疾病的危害
1、蚊媒疾病及其危害伊蚊是蚊类中大属之一，分布很广，其中自纹伊蚊和埃及伊蚊是最重要的虫
媒病毒传播媒介。
以蚊子为媒介传播的疾病称为蚊媒疾病（Mosquito—bornedisease）。
蚊子被形象地比喻为会飞的注射器（flyingsyrings），它们能够轻易地将病原体从一个宿主的血液传给另一个宿主。
蚊子传播的病原体包括了寄生虫、蠕虫，以及虫媒病毒（hrbovirus），如登革病毒（Denguevirus）、黄热病毒（YellowFevervirus）和各种脑炎（Encephalitis）等。
疟疾是蚊媒疾病中最重要的一种，该疾病是由疟原虫（Plasmodium）引发，并通过蚊子来传播。
全世界每年约2亿人感染疟疾，死亡1到2百万人，其中有1百万的死亡发生在非洲。
疟疾的危害除了高死亡率之外，还严重阻碍了疾病发生国家和地区的生活质量的提高以及经济的发展。
虫媒病毒是一类能够在节肢动物体内复制并通过其传播到动物宿主的病毒。
在500多种虫媒病毒中，大约100种能够感染人类（NasciandMitchell，1996）。
伊蚊主要传播黄病毒、脑炎和登革病毒。
对于引起黄热病的黄病毒，已经开发了有效的疫苗。
然而，对于登革病毒还没有有效的疫苗。
全世界有20多亿人面临登革热的威胁，在热带地区每年大约有5千万人染病（Halstead1988：
Monath1994：
RothmanandEnniS，1999）。
降低这些疾病危害的一个关键
升级会员 