一株放线菌的发酵培养及产物分析毕业作品.docx

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一株放线菌的发酵培养及产物分析毕业作品

中文摘要

天然产物的作用越来越大，天然产物的来源主要是植物和微生物。

现在微生物的研究发展迅速，而放线菌作用尤为突出。

本文的实验材料为放线菌，放线菌数量巨大种类繁多，在众多领域发挥着新颖独特不可取代的地位，长久以来在药学、化学、生物学等领域占有及其重要的研究价值，放线菌的应用潜力是我们无法想象到的，至今为止从放线菌中提取出的生物活性物质多于13700种，应用于各个领域发挥作用。

本文通过一系列的分离技术对发酵液进行分离纯化，最终对得到的活性物质进行结构鉴定。

分离纯化得到的化合物样品的结构鉴定主要运用氢谱（1H-NMR）技术与质谱（EI-MS）技术。

最后经过质谱和核磁共振波谱鉴定出了两种化合物的结构和分子量，经过数据分析和文献比对，最终确定了这两种化合物的名称分别是：

1-Hydroxyphenazine和Resistomycin。

关键词：

放线菌发酵分离纯化结构鉴定

ABSTRACT

Thenaturalproductsinmodernsocietyhaveanincreasinglyimportantrole.Thesourceofnaturalproductsisplantsandmicroorganisms.Microbiologicalresearchanddevelopmentisparticularlyrapiddevelopment.Actinomycetescontributeverymuchtonaturalproducts.Theexperimentalmaterialofthispaperisactinomycetes.Thelargenumberofactinomycetesinawiderangeofareasplayauniqueandirreplaceablepositioninmanyfieldsandhavelongbeeninthefieldofpharmacy,chemistry,biologyandotherimportantresearchvalue.Thepotentialofapplicationofactinomycetesissomethingwecannotimagine.Sofarmorethan13,700speciesbio-activesubstancesextractedfromtheactinomycetesareappliedtoplayaroleinvariousfields.

Thetheoreticalbasisofthispaperisnaturalproductchemistry.Therelatedtechnicalmethodsaremicrobialfermentationtechnology,organicsolventextractiontechnologyandcolumnchromatographyseparationtechnology.Firstly,thectinomycetesareexpandedtoferment.Then,Thefermentationbrothisseparatedandpurified.Atlast,thestructureoftheobtainedactivesubstanceisidentified.Thestepofseparationofextractsandthecompletionofthepurificationwascarriedoutprimarilybyreversephasechromatography,SeghadexLH-20,andthinlayerchromatography.Finally,thestructureandmolecularweightofthetwocompoundswereidentifiedbymassspectrometryandnuclearmagneticresonancespectroscopy.Thefinaldefinitionofthesetwocompoundswere1-HydroxyphenazineandResistomycinaccordingtothedataanalysisandliteraturecomparison.

Keywords:

Actinomycetes;ferment;isolationandpurification;structureidentification

结论16

致谢17

参考文献18

第1章前言

第1节放线菌的研究概括

放线菌在科学研究的方面是一类极其重要发挥着巨大作用的微生物资源，同时也是一类G+C含量极高的革兰氏阳性细菌。

放线菌主要以孢子繁殖,其生长方式呈菌丝状。

丰富多样的资源及重要的次级代谢产物使其与人类的生产和生活紧密联系起来[1]。

在此期间，放射性资源和研究开发利用取得了极其辉煌的成就。

迄今为止，微生物产生的两万多种生物代谢活性物质，有将近60%-80%是放线菌产生的包括抗生素、酶和酶制剂、细胞抑制剂、激素等等，其中70%来自链霉菌，15%来自稀有放线菌[2]。

到目前为止已经发现和描述了3000多种放线菌，属于至少56科，超过300属。

放线菌已被独立地作为原核生物界中的放线菌门。

中国科学家对放线菌分类学学科发展做出了重要贡献。

从放线菌中发现超过13700种生物活性物质，占已被人类发现的天然活性物质的40％以上，但是目前临床和农业使用的抗生素超过150种，来源是放线菌的为2/3。

可以说，放线菌药物对促进医疗保健的发展做出了不可磨灭的贡献。

有关放线菌的研究仍然处于基础研究阶段[3]，因此，放线菌资源的开发和利用研究，与国家人口和卫生发展战略的主要需要相一致。

长久以来从放线菌中分离出了许多活性物质，比如邻苯二甲酸二丁酯,又称DBP，曾在微生物的次级代谢产物中多次分离得到,并显示出一定的生物活性。

SavardE.等从青霉菌PenicilliumbilaiiPB-50的次级代谢产物中分离得到该化合物[4]。

EL-Naggar的研究表明链霉菌StreptomycesnasrisubmutantH35产生的邻苯二甲酸二丁酯具有抑菌活性[5]。

邻苯二甲酸二丁酯（DBP）是一种良好的增塑剂，主要用于聚氯乙烯的加工，使制品柔软性良好，也是硝酸纤维素的优良增塑剂[6]。

台勾霉素B可以治疗腹泻，台勾霉素B产生菌包括指孢囊菌、德干高原游动放线菌和短链孢菌等[7]，以上台勾霉素B的产生菌，效价低、产生的类似物多、分离纯化工艺复杂[8]。

第2节分离纯化技术

2.1反相柱层析

在吸附层析中，高极性物质在层析柱上吸附得比较牢。

所以在洗脱过程中高极性物质会发生拖尾现象并且保留比较长的时间。

可是如果在支持物上涂抹一层疏水性强的高碳原子烷烃类，选用极性较强的溶剂作为洗脱液（如甲醇和水的混合物），那么样品中极性比较强的物质就不会被吸附，从而先被洗脱，会产生很好的分离效果。

这种层析法与普通的吸附层析法相反，故称为反相层析。

2.2硅胶柱层析

硅胶层析法的分离原理是物质在硅胶上的吸附力的不同，从而使不同物质得到分离，普遍条件下极性较大的物质容易被硅胶吸附，极性比较弱的物质不容易被硅胶吸附，整个的层析过程可分为吸附、解吸、再吸附、再解吸四个步骤。

硅胶柱的上样方法通常有两种：

干法上样和湿法上样。

干法上样相比湿法上样分离效果更好，但是同样因为之前的拌样，使得化合物和硅胶颗粒的吸附较强，从而会损失不少样品。

如果样品的量比较少的情况通常不适合用这种方法。

本次实验中采用的是干法上柱，干法洗脱。

此方法的优点是分离效果好，缺点是会对样品造成损失，所以小含量化合物不建议使用此方法分离。

2.3薄层色谱（TLC）

薄层色谱贯穿于提取、分离纯化过程的每一步。

它是一种简便、快速、微量的层析方法。

薄层色谱的应用贯穿于整个提取、分离、纯化的每一步。

薄层色谱是将250目的硅胶（GF-254）均匀平铺在铝板或是玻璃板上形成的一种色谱。

薄层色谱的原理同硅胶色谱没有什么分别，但是不同的是，一个是柱色谱，一个是薄层色谱，硅胶分离的样品从柱子中流出装在不同的小瓶中，而薄层色谱的样品停留在色谱板的不同位置。

薄层色谱可以用来分离，也可以用来进行分离效果以及物质纯度的检测。

做分离用途，通常需要很厚很大的板子，将化合物停留的部分抠下来溶解得到。

通常，我们会使用到薄层色谱的分离效果以及物质纯度检测的功能，这时只需要消耗很少量的化合物。

薄层显色有三种常用的方法：

可见光（有颜色的化合物），紫外光（365nm，254nm），显色剂。

它的原理是将250目（GF-254）硅胶铺在玻璃、塑料或者铝箔板上,把待分离样品滴加在一端，用溶剂展开，由于样品中各成分与硅胶之间的吸附能力有所不同，最后被展开剂携带到不同的距离，从而使样品得到分离。

2.4Sephadex柱层析色谱

凝胶滤过法，即利用分子筛分离物质的方法。

此方法中用到的载体是葡聚糖凝胶，此物质不溶于水，但在水中可膨胀成球形颗粒，并且具有三维的空间网状结构。

当其在水中充分膨胀后，再将其加入色谱柱，并加入试样混合物，再用同一溶剂洗脱时，由于凝胶网孔半径对物质的进出产生阻碍，大分子将不能在凝胶颗粒的内部自由活动。

因此大分子在颗粒间隙移动时，只能随溶剂从柱底流出。

小分子则可以进入凝胶颗粒的内部，因此，小分子通过色谱柱时路径较长，因而较慢流出。

凝胶柱的洗脱剂，通常是一种，但是有两种不同极性溶剂梯度洗脱的话，可能能达到分子筛和反相共用的效果，会有更好的分离效果。

但是要注意，洗脱剂的密度不能高，否则凝胶凝胶漂起来的话，就达不到分离的效果了。

第3节结构研究主要技术

3.1质谱

质谱技术主要通过测量离子电荷质量比（电荷-质量比）来分析分子质量和结构。

基本原理是，真空系统中的样品化合物在电子流的冲击下分散在带中，分子离子和碎片离子的正电荷，分子离子和不同质量电荷的碎片离子，它们将根据尺寸而变化根据排列形成质谱的不同位置的顺序不同的尺寸。

质谱仪由进样系统、离子源、质量分析器、检测器、记录系统五部分组成，按照用途可分为同位素质谱仪、无机质谱仪、有机质谱仪；按照质量分析器的工作原理可分为静态仪器、动态仪器[9]。

质谱仪能用高能电子流等轰击样品分子，样品分子会失去电子从而变为带正电荷的分子离子，分子离子能进一步裂解，生成质量更小的碎片离子。

这些不同离子具有不同的质量，质量不同的离子在磁场的作用下到达检测器的时间不同，其结果为质谱图。

原理公式：

q/m=2v/B2r2。

质谱是目前唯一能够确定分子量，给出分子式的方法，对于结构鉴定至关重要。

质谱进样量少，灵敏度高。

3.2核磁共振波谱（NMR）

核磁共振光谱是指从外部磁场的原子水平，从一个自旋能级到另一个自旋能级的电磁波吸收，其原理与核的自旋角动量和磁矩有关。

1905年，科学家发现质子的振动频率与其结构有关。

吸收峰在高频下发生化学位移并破裂。

最后得到化合物的NMR光谱。

通过光谱获得质子的化学环境。

由此得到化合物的结构。

核磁共振光谱仪由永磁体，RF振荡器，射频信号接收器，样品管。

影响化学位移的因素是电负性，磁各向异性效应，价电子，苯环[5]。

核磁共振波谱是研究物质结构最常用和最重要的方法之一。

核磁共振波谱是指位于外磁场中的原子核吸收电磁波后从一个自旋能级跃迁到另一个自旋能级而产生的吸收波谱。

我们能够通过波谱图上共振峰的位置，强度和精细结构来研究和判断分子的结构。

3.3紫外-可见吸收光谱

UV-Vis吸收光谱对具有共轭双键的化合物，发色团和具有200-700nm范围内的共轭体系的发色团分子具有吸收效果。

UV-Vis吸收光谱是指吸收外部辐射的运动分子的外电子，导致电子能级跃迁，产生分子吸收光谱。

具体操作是让不同波长的光通过化合物，不同波长的化合物的光吸收不同程度，测量其吸收不同波长的光的吸光度，将波长的光作为横坐标，吸光度为垂直轴材料的吸收曲线，吸收曲线吸收峰强度，位置，数量等特点进行了研究。

紫外可见吸收光谱广泛用于无机物质和有机物质的定性和定量测定。

具有灵敏度高，精度高，应用范围广，操作快捷方便的特点。

紫外分光光度计由光源，单色仪，吸收元件，检测器，信号指示系统部件五部分组成[6]。

3.4红外光谱

红外光谱用于研究化学键。

红外光谱分析首先需要掌握振动频率的因素和化合物的红外吸收带，根据峰面积来猜测可能的归属带，结合其他相关峰确定其归属，在其他基础上光谱分析确定其结构。

当辐射满足材料水平的转变和辐射与物质的耦合所需的能量时，产生红外光谱。

红外光谱法的原理在于化学键的振动能级不同，具有不同的频率。

当一束红外光通过被测量的样品时，各个波长上的能量吸收会被记录下来。

这可以由连续改变使用的单色波长来实现，也可以用傅立叶变换来一次测量所有的波长。

这样的话，透射光谱或吸收光谱或被记录下来，显示出被样品红外吸收的波长，从而可以分析出样品中包含的化学键。

我们可以通过红外光谱来鉴定分子中的特定官能团。

红外光谱广泛用于有机化合物的分析（通过吸收频率特性的特征和特征峰值强度的特征）。

同时在天文学中，物理学，医学也具有很大的潜力[7]。

第4节研究背景、目的和意义、方法和路线

4.1研究背景

近几十年来，天然产物在开发新药方面取得突破。

对于天然产物来源，除植物外，微生物也占主要地位，其中放线菌的作用特别大。

据统计，从微生物中提取出34000种天然活性物质，其中放线菌占35％以上.使用放线菌生产抗菌，抗肿瘤等天然活性物质，不仅为新药开发提供了新的途径，而且有效保护了珍稀濒危药用植物资源，具有重要的生态意义和经济价值[10]。

放线菌作为代谢产物的来源可分为抗生素，抗癌物质，免疫抑制剂，植物生长激素和酶。

从抗菌，抗肿瘤作用分离的放线菌，天然而不是抗病毒药用植物，不仅可以减少药用植物，特别是药用植物的发育受到威胁太多，而且还为保护新药提供保护伟大的生态价值和经济价值的新价值[11]。

放线菌是一种具有巨大发展潜力的微生物资源。

这种生命系数高，可以传播持久性物种资源，为人类可持续发展提供技术支撑，应对能源危机，环境危机污染和气候变化[12]。

4.2研究的目的、意义

药用植物具有独特的药理活性，特别是在治疗某些困难疾病方面具有不可替代的作用。

如陈陈参与黄疸肝炎，肝硬化，肝腹水等肝病;Stellerachamaeks主宰结核病，哮喘等，也具有抗肿瘤作用,药用植物活性成分的提取和研究一直是全国热门话题[13]。

生物，医药，化学等天然产物领域的现代社会具有很大的研究价值和潜力，微生物生产天然产物的使用是放线菌有重要贡献的重要途径。

放线菌产生的次生代谢产物是非常重要的生物活性物质来源，如医用抗生素，抗癌剂，免疫调节剂，农药杀菌剂和杀虫剂[14]。

本实验旨在将放线菌放线菌的发展前景看作是继续研究放线菌的物质，希望能够对放线菌发酵产生次生代谢产物进行研究，以分离新化合物目前，近100种抗生素分离放线菌广泛应用于医疗诊疗和农业。

可以说放线菌对医疗保健做出了巨大贡献，放线菌在其他领域的应用也值得我们期待研究[15]。

因此，根据科学发展要求和人类社会需要，继续加强放线菌的发展。

4.3研究的方法和路线

拟采取的研究方法及研究手段：

首先筛选菌株，选择优良菌株产生更优异的菌株，然后用液体培养基发酵[16]。

将得到的发酵产物萃取并用有机溶剂萃取。

提取物通过柱色谱法分离纯化，得到单体化合物，最后与质谱法和核磁共振光谱法结合鉴定。

即：

（1）放线菌的大批发酵培养

1）菌种的保存。

2）菌种的活化

3）培养基的配置

4）高压蒸汽灭菌

5）超净工作台接种

6）摇床培养

（2）放线菌次生代谢产物的提取

1）发酵液的前期处理

2）发酵液的提取分离

（3）放线菌提取物的分离纯化

（4）化合物结构鉴定

研究路线如下：

第2章放线菌种扩大培养

实验前期放线菌的扩大发酵在实验全程有着至关重要不可或缺的地位，同时扩大发酵这一步消耗时间较长，本实验采取高氏1号培养基（可溶性淀粉20g，KNO31g,K2HPO40.5g,MgSO4·7H2O0.5g,NaCl0.5g,FeSO4`7H2O0.01g,重铬酸钾0.025g，PH=7.4-7.6）作为放线菌扩大发酵的培养基。

第1节实验材料、试剂、仪器

1.1实验材料

放线菌LX-007

1.2实验试剂

可溶性淀粉20g

KNO31g

K2HPO40.5g

MgSO4·7H2O0.5g

NaCl0.5g

七水硫酸铁0.01g

重铬酸钾0.025g

1.3实验仪器

超净工作台高压蒸汽灭菌锅漏斗玻璃棒摇床

第2节放线菌的扩大发酵

2.1菌种的保存

为保证今后实验的准确性，将放线菌密封保存，确保菌种的纯度，为实验提供可靠的材料。

2.2菌种的活化

对保藏的放线菌菌种进行活化，将在试管中冷藏的放线菌在室温下解冻，并在超净工作台下，用接种环挑取少量的菌落在事先配好并灭好菌的高氏一号培养基上划线接种，处于28℃的恒温培养箱中培养一周，定期观察菌种的生长状况，从而打破其休眠眠状态恢复到活化状态[15]。

2.3培养基的配置

表1.1高氏1号培养基（1L）

药剂

可溶性淀粉

KNO3

K2HPO4

MgSO4·7H2O

NaCl

七水硫酸铁

重铬酸钾

量

20g

1g

0.5g

0.5g

0.5g

0.01g

0.025g

按照表格各药剂之间的配比配置若干瓶500毫升锥形瓶的液体培养基，然后封口并灭菌。

2.4高压蒸汽灭菌

将以上操作得到的锥形瓶放入高压蒸汽灭菌锅内进行分批灭菌[16]。

2.5超净工作台接种

准备好无菌条件后正式开始接种。

2.6摇床培养

锥形瓶转移到摇床，首先处于25℃的条件下静置培养1.5天，之后置于25℃、150rpm/min的条件下，振荡培养一星期，若有杂菌污染需要及时地做出处理，以免造成整个实验的失败。

图1.放线菌发酵培养

第3章放线菌次生代谢产物的提取

第1节实验材料、试剂、仪器

1.1实验材料

放线菌发酵液

1.2实验药剂

二氯甲烷、丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、正己烷、石油醚、正丁醇、柱层析用硅胶、薄层层用硅胶板

1.3实验仪器

FW-400A倾斜式高速万能粉碎机、旋转蒸发仪、超声清洗机、便携式紫外检测灯、电热恒温水浴锅、循环水式多用真空泵、D101大孔吸附树脂、玻璃棒、分液漏斗

第2节发酵液的提取分离

2.1发酵液经过大孔吸附树脂

发酵液通过纱布过滤流入大孔吸附树脂柱，一段时间重复此操作，注意间隔的时间段内不能让树脂柱流干，这个过程旨在去除大孔吸附树脂柱中的水溶相。

之后用甲醇冲洗至甲醇无色为止。

2.2放线菌次生代谢产物提取物的萃取

对上述得到的锥形瓶中含有甲醇的浓缩物进行萃取，萃取过程重复三次直到石油醚萃取相无明显颜色变化，石油醚萃取相编号是Q1。

接下来剩余分层的溶液用乙酸乙酯萃取，上下颠倒多次使之充分混合，静止待其分层后倒出萃取相，此步骤重复三次，乙酸乙酯萃取相编号是Q2。

再用正丁醇萃取与乙酸乙酯分层的溶液，重复上述过程，在锥形瓶中收集的正丁醇萃取相编号为Q3。

最后将上述萃取液旋转蒸发，使其中的液体完全蒸出，Q1、Q2、Q3保存。

第4章放线菌次生代谢产物的分离纯化

第1节实验材料、试剂、仪器

1.1实验材料

放线菌发酵液萃取物

1.2实验试剂

甲醇、二氯甲烷

1.3实验仪器

SephadexLH-20凝胶柱、反相色谱柱、薄层色谱板、便携式紫外检测灯、ZF-6型三用紫外分析仪、显色剂（香草醛浓硫酸）、移液枪、旋转蒸发仪。

本实验此部分对萃取得到的乙酸乙酯部分进行分离纯化。

乙酸乙酯萃取浓缩物Q2用少量丙酮溶解，溶解后与一定量80—120目的硅胶混合拌匀，然后把溶液加热，使溶液完全蒸熟，完全干燥，用这部分作为样品层，将200-300目硅胶倒入其中，再倒入样品，抽真空，最后在保护层使用80-120目的硅胶,这部分的硅胶量略高于硅胶的样品层的数量。

二氯甲烷和甲醇的梯度洗脱液，得到三个部分，编号为Q2.1、Q2.2、Q2.3。

1.4Q2.1部分分离

对Q2.1部分进行硅胶柱层析后得到三个部分，编号为Q2.1.1、Q2.1.2、Q2.1.3。

1.4.1Q2.1.1部分分离

对Q2.1.1部分进行反相柱层析和凝胶柱层析，由于最后得到的样品量太少，无法进行接下来的实验，所以对此部分决定不予继续。

1.4.2Q2.1.2部分分离

对Q2.1.1部分进行反复多次的硅胶柱层析和反相色谱柱层析，最后得到的化合物经分析纯度不高，所以也没有研究意义。

1.4.3Q2.1.3部分分离

对Q2.1.1部分进行反复多次的凝胶柱层析和反相色谱柱层析，所得产物较纯净，对其编号为LXJ-1并送去打谱，打谱后分析鉴定此化合物纯度不高无法得到其结构信息。

1.5Q2.2部分分离

对Q2.2部分进行凝胶柱层析后得到四个部分，编号为Q2.2.1、Q2.2.2、Q2.2.3、Q2.2.4。

1.5.1Q2.2.1部分分离

对Q2.2.1部分进行反相色谱柱层析，所得化合物纯度不高，所以放弃对此部分的研究。

1.5.2Q2.2.2部分分离

Q2.2.3部分样品量太少，没有继续研究的意义。

1.5.3Q2.2.3部分分离

对Q2.2.3部分进行硅胶柱层析，所得产物较纯净，编号为LXJ-2，打谱成功获得其相关信息并鉴定出其结构。

图2.Q2.2.3部分化学成份薄层色谱分析（紫外365nm）

1.5.4Q2.2.4部分分离

对Q2.2.4部分进行反相色谱柱层析，获得化合物干净，编号为LXJ-3，打谱后未得到其相关信息及结构，具体原因还未分析出有待探讨研究。

图3.Q2.2.4部分化学成份薄层色谱分析（紫外365nm）

1.6Q2.3部分分离

对Q2.3部分进行凝胶柱层析后得到三个部分，分别编号为Q2.3.1、Q2.3.2、Q2.3.3。

1.6.1Q2.3.1部分分离

对Q2.3.1部分进行硅胶柱层析，最后得到的化合物经分析纯度不高，所以没有研究意义。

1.6.2Q2.3.2部分分离

对Q2.3.2部分上反相色谱柱层析，获得化合物不纯净，决定对其进行RP-18反相柱层析，此时洗脱剂为水和甲醇，进行梯度洗脱后获得纯度较高的化合物，编号为LXJ-4，打谱后获得其相关信息及结构。

1.6.3Q2.3.3部分分离

Q2.3.3部分样品量太少，没有继续研究的意义。

第5章放线菌种的化合物鉴定

第1节实验材料、样品、仪器

1.1实验材料

放线菌发酵液

1.2实验样品

发酵液经分离纯化得到的活性物质LXJ-2、LXJ-4

1.3实验仪器

质谱仪（VGAutospec-3000spectroZeter），核磁共振仪（BrukerAV-40和DRX-500型）。

1.4结构分析

据核磁共振氢谱以及质谱图分析，可以得出化合物LXJ-2的分子量为196.209。

通过化合物的波谱分析和相关文献对照，化合物LXJ-2的结构与数据库中已发现的天然产化合物1-Hydroxyphenazine相一致，故化合物LXJ-2