发酵工程笔记.docx

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发酵工程笔记

发酵工程笔记

（来自讲义）

1、致死温度杀死微生物的极限温度

致死时间在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间

2、微生物的热阻微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间

3、实罐灭菌培养基置于发酵罐中用蒸汽加热，达到预定灭菌温度后，维持一段时间，再冷却道发酵温度，然后接种发酵。

4、微生物的特点体积小、面积大，吸收快、转化快，生长旺、繁殖快，易变异、适应性强，种类多、分布广等五大特性。

5、菌种分离的一般过程

土样的采取→预处理→培养→菌落的选择→产品的鉴定

目的：

高效地获取一株高产目的产物的微生物

6、生物热（Q生物）

在发酵过程中，菌体不断利用培养基中的营养物质，将其分解氧化而产生的能量，其中一部分用于合成高能化合物（如ATP）提供细胞合成和代谢产物合成需要的能量，其余一部分以热的形式散发出来，这散发出来的热就叫生物热。

（来自PPT）

第一章绪论

1、发酵工程：

利用微生物的生命活动进行物质加工的过程。

第二章生产菌种的筛选

1、新种分离筛选的步骤

1）定方案：

首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。

2）采样：

有针对性地采集样品，以采集土壤为主。

3）增殖：

人为地通过控制养分或培养条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。

4）分离：

利用分离技术得到纯种。

5）发酵性能测定：

进行生产性能测定。

这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。

2、采土方式：

在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。

为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。

3、采样注意事项

1）采样时应尽可能保持相对无菌；

2）所采集的样本必须具有某种代表性；

3）采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等；

4）应充分考虑采样的季节性和时间因素

，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的

5）采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。

这是因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长。

4、水样采集方法

1）用于细菌检测的水样应收集于100ml干净、灭菌的广口塑料或玻璃瓶中。

2）由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静水层中采集水样。

3）方法是：

握住采样瓶底浸入水中30-50cm处，然后瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。

如果有急流存在的话，应直接将瓶口反向于急流。

采集瓶从水中取出时应迅速并带有较大的弧度。

水样不应装满采样瓶。

所有水样都应在24h之内迅速进行检测，或者4℃下贮存。

5、发酵工程所利用微生物的特点

1）对周围环境的温度、压强、渗透压、酸碱度等条件有极大的适应能力

2）有极强的消化能力

3）有极强的繁殖能力

6、发酵工程三要素

1）生产菌种的性能（即高产菌株）；

2）科学的生产管理（包括补料发酵等）；

3）先进的生产设备。

7、一般筛选菌种步骤如下

标本采集→材料预处理→富集→菌种分离初筛→性能测定→菌种的应用与保藏。

第三章优良菌株的选育

1、一个优良的生产菌株应具备以下的基本特性：

1）发酵周期短，代谢能力高：

在不增加生产投资的前提下能大幅度提高企业的产量；

2）附产物少：

发酵过程中，与目标产品近似的附产物少，这样既能提高转化率，又能减轻提取分离的难度；

3）繁殖能力强：

有较强的生长速率，产孢菌株应有较强的产孢子能力。

这样既能缩短生产周期，又可减少污染。

4）利用底物原料（如碳、氮源）广泛：

对原料波动的敏感性小，使发酵可用价兼，来源广泛的原料；

5）原料转化率高：

能高效地将原料转化为产品，以提高市场竞争力；

6）对添加的前体物质有耐受能力，不以该物为碳源利用；

7）在发酵过程中产生泡沫少，这样可提高发酵的装填系数，达到提高产量，降低成本的目的；

8）具有抗噬菌体感染能力；

9）遗传特性稳定，以减少复壮次数。

2、自然选育（spontaneous

mutation），自然选育是从自然界筛选非人工诱变产生的生产菌株。

一般认为自然界菌株变异由两种原因引起，即多因素低剂量的诱变效应和互变异构现象：

1）多因素低剂量诱变效应：

指低剂量的宇宙射线，各种短波辐射，低剂量的诱变物质作用引起的突变。

2）互变异构效应：

指DNA复制时，四种碱基第六位上的酮基或氨基的瞬间变构而引起的碱基错配。

这种几率在自然界具统计在1x10。

3、自然变异的菌株会导致两种不同结果：

一是导致产品产量或质量下降；二是对生产有益的突变。

因此生产上要经常进行菌种自然选育，从而淘汰退化的，选出优良的生产菌种。

自然选育是用平板稀释法，分离出单菌落，再测试菌种的生产能力，从而选出高水平菌株。

它是一种简单易行的选育方法，可以达到纯化菌种、防止退化，稳定生产，提高产量的目的。

自然选育效率较低，因此常与诱变育种交替使用，以提高育种效率。

4、诱变育种，利用物理化学或生物制剂等因素，使微生物的遗传物质发生变异导致物种的遗传性状改变，从而获得生产上的优良菌株的这类方法统称诱变育种。

诱变处理方法

物理法：

包括紫外线、X射线、r-射线，快中子、电场，磁场和激光等。

化学诱变剂：

如碱基类似物（2-氨基嘌呤，5-溴尿嘧啶8-氮鸟嘌呤）；与碱基反应的物质（硫酸二乙酯、亚硝基胍、亚硝基乙基脲、亚硝酸等）；在DNA分子中插入或缺失一个至多个碱基的物质（丫啶类物质、丫啶氮芥衍生物，用一定剂量及合理的使用方法处理出发菌，然后再通过测试，直至筛选出高产菌株。

）

生物诱变剂：

利用噬菌体、转座子将遗传物质DNA片断载入细胞，使其在复制过程中嵌入新的信息，由此获得高产菌株。

复合处理：

用两种以上的诱变剂先后处理菌株，实践证明复合处理要比单一处理突变率要高3—4倍，金色链霉菌的高产株就是用紫外和乙烯亚胺复合处理后筛选得到的。

5、突变类型

经诱变后的菌株有很多突变类型，主要分为形态突变型和生理突变型，二者也有相互联系。

1）形态突变型：

菌落形态变异、菌落大小、表面结构、边缘形状、颜色等发生变化；

菌丝形态变异：

菌丝粗细、曲、直，气生菌丝分枝，孢子丝形状等；

细胞及孢子形态变异：

细胞和孢子的形态大小产生变化。

2）生理突变

生产性能变异；目的代谢物是否提高，副产物是否减少；

颜色与色素变异：

颜色是指营养细胞，菌丝及孢子的颜色，色素是指溶于基质中的色素，这些变化往往与生产性能相关；

发酵变异：

在培养过程中能否利用某些碳源或氮源，

营养缺陷型：

表现在生长过程中缺乏某一生长物质，如不能从外界补给便不能生长繁殖，这些缺陷型主要有氨基酸，维生素嘌呤和嘧啶等缺陷型；

抗性突变：

如抗噬菌体能力，抗高温，抗高渗透压等能力发生变化；

抗药性突变：

对某一药物或抗生素浓度的抗性增强或减弱，抗菌素的生产与药性有关。

6、杂交育种，通过有性生殖、准性生殖和细胞融合等方式，让两个表型差异较大的菌株之间的基因重组，使其亲本的优良性状组合到一起，得到提高产量和质量的新菌株，这种方法称为杂交育种。

1）准性生殖，一种类似于有性生殖但比有性生殖原始的一种繁殖方式。

其过程为：

质配→核配→单倍体化，不通过减数分裂而导致基因重组，为杂交育种提供了条件，该过程可分为三个阶段：

异核体的形成：

由不同性状的亲本菌丝相互吻合，形成一个细胞里含有两个不同遗传性状的细胞核；

杂合双倍体的产生：

在异核体的基础上，两个不同遗传性状的细胞核偶尔融合，出现具有杂合双倍体的细胞（多为菌丝体）；

重组体形成：

杂合双倍体极不稳定，在进行有丝分裂过程中，极少数细胞发生染色体交换（体细胞交换）和单元化（即双倍体细胞经多次分裂转变为单倍体细胞）而产生重组体。

7、营养缺陷型：

菌株经诱变处理后其变异株在营养上表现出某些营养缺陷，故需在培养基中加入某些组分（即补充培养基）才能生长，可用基础培养基和补充培养基对照培养将其检出。

8、原养型：

能在两种营养缺陷型培养基上生长的重组型菌株；

9、野生型：

在发生变异之前的出发菌株。

10、基本培养基（MM）：

能满足野生型和原养型生长的合成培养基，营养缺陷型菌株不能生长的培养基；

11、补充培养基（SM）：

在MM里添加某些物质（如：

维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等），使营养缺陷型菌株生长的培养基。

12、完全培养基（CM）：

在基本培养里加入蛋白质，酵母膏等天然物质，可满足多种营养缺陷型菌株生长的培养基。

13、生产基因工程菌的主要程序：

克隆目的基因→构建DNA重组体→重组DNA导入宿住细胞→基因表达及工程菌的筛选

14、原核表达系统

1）大肠杆菌：

由于生长繁殖迅速，对该菌分子遗传学研究比较深入，以至目前它仍是基因工程中最常采用的原核表达系统。

大肠杆菌的表达形式多种多样，有细胞内不溶性表达（包含体）、胞内可溶性表达。

2）枯草芽孢杆菌：

该菌分泌能力强，可将蛋白产物直接分泌到胞外，不形成包含体，它也不能使蛋白质产生糖基化。

有很强的胞外蛋白质酶，能不同程度地降低产物，故在表达系统中受影响。

3）链霉菌；重要的工业微生物，作为源基因表达系统有着不致病使用安全，分泌能力强，能将产物分泌到胞外，具有糖基化能力。

其中变铅青链霉菌限制能力弱，是一个理想受体菌，现已构建系列载体，培养工艺也比较成熟。

15、真核表达系统

1）酵母：

是研究基因表达调控最有效的单细胞生物，其基因组较小，仅为大肠杆菌的4倍，世代周期短，有单、双倍体两种形式，加之酵母生长繁殖快，易培育。

不产生毒素，基因工程操作方便，与原核生物相似，表达产物能糖基化，故被认为是真核蛋白质的最佳表达系统。

目前如干扰素，乙肝表面抗原基因等已在酵母中成功地表达。

2）丝状真菌

第四章菌种的退化复壮和保藏

1、退化现象

1）对产量性状来说，菌种的负变就是衰退。

2）其他原有的典型性状变得不典型时，也是衰退。

最易觉察到的是菌落和细胞形态的改变。

3）生长速度缓慢，产孢子越来越少。

4）代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降。

5）衰退还表现在抗不良环境条件（抗噬菌体、抗低温等）能力的减弱等。

2、退化的原因

1）自发负突变：

在自然光照或微量诱变剂的刺激下发生的基因突变；或经杂交育种的菌株性能不稳定而产生的回复突变，造成的菌株性能的负突变现象；

2）培养条件影响：

如温度时高时低，营养组分不稳定，PH，溶氧等因素不稳定都会导致菌种退化；

3）传代次数：

传代次数多也是菌种退化的原因之一。

3、防止退化的措施

1）防止基因自发突变

低温保藏菌种（0-4℃），使菌株处于休眠状态下较为稳定；

设置遗传障碍：

营养缺陷型菌株的回复是由于原来的遗传性障碍被解除，可给该类菌株设置回复障碍。

如：

给腺苷酸生产菌添加琥珀腺苷酸；鸟苷酸生产菌添加黄嘌呤核苷酸等保护剂（或称诱变障碍）。

可使菌株的性能相对稳定。

2）防止退化细胞在群体中占优势

少传代：

一般情况下每传一代，霉菌，芽孢杆菌，放线菌在低温（0-4℃）下可保藏半年左右，酵母在三个月左右，可将以上菌种在一次性转接时多接一些斜面，以减少移植代数；

单细胞分离纯化：

定期的单细胞分离纯化也是防止退化的主要手段之一，即每次挑出性能优良的单菌落培养使用。

选择合适的培养条件：

根据各生产菌种的性能，保证其相适应的温度、PH、营养等最佳条件。

4、复壮的概念

1）狭义的复壮仅是一种消极的措施，它

指的是在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定生产性能等方