黑曲霉发酵产性蛋白酶.docx

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黑曲霉发酵产性蛋白酶

江西科技师范学院

生物工程专业《化工原理课程设计》说明书

题目名称黑曲霉发酵生产酸性蛋白酶

专业班级09级生物工程1班

学号

学生姓名钟鑫鑫张溧王涛

指导教师常军博士

2011年10月31日

前言

蛋白酶做为一种重要的工业酶制剂，作为一种较早被人们了解的酶类现在正在人类的生活中发挥巨大的作用，特别是酸性蛋白酶以其作用的广泛性、高效率越来越多的受到了人们的关注。

在酸性环境下（pH2.5-5.0）催化蛋白酶水解的酶制剂，适用于酸性介质中水解动植物蛋白质。

该酶主要用于酒精发酵、啤酒酿造、毛皮软化、果酒酱油造、饲料等。

其使用于酒精、白酒、果酒、啤酒、黄油以可澄清发酵醪液和成熟醪液。

酶作为一种新兴的物质以其高效，清洁的催化效果充斥着当今人类的思想，但是较高的技术要求和特殊菌株获得，使人们在酶这一产业发展中步履蹒跚，特别是发展中国家由于落后的科学技术，使他们在此项技术中发展更加困难，以中国为例在20世纪90年代就已经有酶企业投入生产，但是我的酶制剂销售额在世界市场只占4%，我国企业所用的酶制剂大多数是由丹麦的NOVO所提供的。

就目前情况看，世界各国都投入了大量资金用于酶事业的研究和生产。

相信在不久的将来酶一定会更加广泛的在生活中应用。

设计条件

题目:

1000L发酵罐，发酵生产酸性蛋白酶。

1发酵工艺

1.1菌种的选择

本实验选用黑曲霉作为菌种，发酵生产酸性蛋白酶，该霉菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为3．350。

1.3菌种培养基的配制

查氏培养基

NaNO32g

K2HPO41g

KCl0.5g

MgSO40.5g

FeSO40.01g

蔗糖30g

琼脂15g

水1000mL

pH自然

121℃灭菌20min

1.2发酵罐培养基的配制

一般产酸性蛋白酶的微生物，它们的发酵培养基都基本选择麸皮、米糠、玉米粉、淀粉、饲料鱼粉、豆饼粉、玉米浆等各种碳氮源，按各种不同比例混合，添加无机盐配成各种培养基。

在黑曲霉生产蛋白酶时，培养基中除需要高浓度的有机氮外，还得添加1%～3%的无机氮。

蛋白胨对黑曲霉生产酸性蛋白酶有很强的诱导作用。

就黑曲霉3.350研究表明只有几种有机氮可以将它代替，其中已豆饼、蚕蛹、鱼粉的石灰水解物为最好。

以下的培养基适合大多数。

黑曲霉生产酸性蛋白酶，其组成是豆饼粉、玉米粉、和鱼粉比为6：

1：

1混合物5%，豆饼石灰水解物10%，NH4Cl1%，CaCl20.5%，Na2HPO40.2%，pH5.5～6.0。

本实验选择黑曲霉3．350发酵培养基的配方：

黑曲霉3．350发酵培养基的配方：

　　豆饼粉3.75％玉米粉0.625％

　　鱼粉0.625％氯化铵1.0％

　　氯化钙0.5％磷酸二氢钠0.2％

　　豆饼石灰水解液10％pH5.5

1.3酸性蛋白酶的提取

用粗制酶采用盐析法提取，将培养物滤去菌体用盐酸调节pH4.0以下，加入硫酸铵至浓度55%，静止过夜，倾去上清液，沉淀压滤去母液，于40℃烘干后磨粉。

盐析工艺受率94%以上，干燥后收率60%以上，每克酶活性为20万U左右。

甲法：

发酵液→离心除去菌体→粗酶→加水浸泡（pH3）→过滤→然后把两者滤液→盐（硫55％铵）→压滤→酶泥→溶于pH2.5，0.005mol/L乳酸缓冲液→离子交换树脂脱色→脱色液（收率93%）→40℃→真空薄刮板蒸发器浓缩2倍以上（收率90%）→离子交换树脱盐（收率90%）→喷雾干燥或冷冻干燥→磨粉（淡黄至乳白色粉末，酶活40～60万U/g）。

1.4发酵罐接种量

适当控制接种量对菌株产酸性蛋白酶的活力关系很大。

本实验采用6ml/100g，即6％.

1.5氧载体

在发酵过程中，在发酵培养基中加入正十二烷、全氟化碳，液态烷烃（为12—16碳直链烷烃混合物）等氧载体，使培养基中氧传递速度加快，产生气泡少，剪切力小，能明显提高菌株产酸性蛋白酶的量。

1.6发酵工艺流程图

如图：

酸性蛋白酶生产的总工艺流程见图1。

通氧

图1酸性蛋白酶生产总工艺流程图

1.2发酵罐尺寸及整体设计

本实验采用菌种为好氧菌所以选用机械搅拌通风发酵罐，可采用分批时发酵。

a、公称容积，指罐的圆柱部分和底封头容积之和，并圆整为整数。

b、罐的全容积，指罐的圆柱部分和两封头容积之和

工艺参数和高径比确定各部几何尺寸；设定高径比H/D=2，则H=2D

设定全体积V0=1000L=1

ha=0.25D

公称体积V－－罐的筒身（圆柱）体积和底封头体积之和

全体积V0－－罐的筒身（圆柱）体积和上下封头体积之和

圆柱体积VC

上封头体积=下封头体积=Vb

V0=VC+2Vb

VC=（π/4）D2H

Vb=

可近似Vb=（π/24）D3

V0=（π/4）D2H+2（π/24）D3=（7π/12）D3

代入V0=1即可求得D≈0.82m

发酵罐实际体积V0=（7π/12）D3=1010L

②发酵罐圆筒壁厚的计算

该发酵罐采用双面对焊GB150-89钢制焊接压力容器，许用应力标准为：

[a]t＝137Mpa

a计算发酵设备圆筒壁厚的一些参数如下：

计算壁厚：

=PD/（230[a]t

-P）+C

式中：

---计算壁厚mm；

P---计算压力,本实验压力在7.6×103pa=760Mpa

Di---内径，82mm；

[a]t---设计温下的许用应力；

---焊封系数（与焊接方法及无损探伤有关），取0.8；

设计壁厚

设＝壁厚+腐蚀量C

C--腐蚀量（每年腐蚀的量）。

C取3mm

=PD/（230[a]t

-P）+C=（760×82）/（230×0.8×137-760）+3

=5.55≈6mm

发酵罐各部分尺寸计算结果如下：

项目及代号

参数及结果

发酵罐设计全体积L

1000L

发酵罐实际全体积L

1010L

发酵罐实际公体积L

940L

罐体直径D（m）

0.82m

发酵罐总高H0

2.05m

发酵罐筒体高度H

1.64m

冷却列管厚度B

0.08m

搅拌叶直径Di

0.27m

椭圆封头短半轴长h

0.21m

底搅拌叶至封头底部高度C

0.27m

搅拌叶间距S

0.82m

筒壁厚度

6mm

封头厚度

8mm

人手孔规格

椭圆400X300

搅拌转速

250r/min

轴径

40mm

搅拌器型式

6-6

弯叶

搅拌器层数

2

电动机型号

Y123M1

—6

电动机功率

4kW

电动机转速

960r/min

罐压

7.6×103pa

1.3、手孔的设计

手孔的设置是为了安装、拆卸、清洗和检修设备内部的装置。

本次设计只设置了1个人孔，标准号为：

椭圆400X300，开在顶封头上，位于左边轴线离中心轴5cm处。

视镜用于观察发酵罐内部的情况。

本次设计只设置了2视镜，标准号为Dg80

支座选择：

发酵设备常用支座分为卧式支座、耳式支座和立式支座。

其中卧式支座又分为支腿，圈型支座，鞍型支座三种。

立式支座也分为三种即：

悬挂支座，支撑式和裙式支座。

对于1000L发酵罐，由于设备总重量不大，可采用耳式支座。

接口管：

以进料口为例计算，

设发酵醪液流速为v=1m/s，0.5h排尽。

发酵罐装料液体积：

V1=70%V=0.94×0.7=0.658m3

物料体积流量Q=V1/0.5h=0.658/（3600×0.5）=0.0003655m3/s,

则排料管截面积F=Q/v=0.0003655/1=0.0003655m2，

又F=0.785d2，得d=0.022m，取无缝钢管，查阅资料，平焊钢管法兰HG20593-97，取公称直径2cm，其他管道也是如此计算。

3.6.1管道接口（采用法兰接口）

进料口：

直径，2cm,开在封头上，

排料口：

直径，2cm，开在罐底；

进气口：

直径，2cm，开在封头上；

排气口：

直径，2cm，开在封头上；

冷却水进、出口：

直径，2cm，开在罐身；

补料口：

直径，2cm，开在封头上；

取样口：

直径，2cm，开在封头上；

3.6.2仪表接口

温度计；装配式热电阻温度传感器Pt100型，D＝100mm，开在罐身上；

压力表；弹簧管压力表（径向型），d1=20mm，精度2.5，型号：

Y-250Z，开在封头上；

液位计：

采用标准:

HG5-1368型号：

R-61直径：

Φ550（260×14）mm，开在罐身上；

溶氧探头：

SE-N-DO-F；pH探头：

PHS-2型

名称

测定方法

意义及主要作用

酸碱度（pH）

pH传感器

反映菌体的代谢情况

溶解氧/mg·L-1

溶氧传感器

反映氧的供给和消耗情况

排气氧浓度/Pa

氧传感器

了解氧的消耗情况

二计算

2.1通风量的计算

通风量是影响黑曲霉生产酸性蛋白酶的另一个重要因素，通风量不足，虽不影响菌体生长，但不能产酶。

实验表明：

在500L发酵罐中，使用黑曲霉3.350发酵生产酸性蛋白酶的时候，前24h前的通风量为0.25VVm，24～48h0.5VVm，48～72h1.0VVm。

在48h通风量如果未及时增至1.0VVm，就会导致产酶降低，即使恢复了正常的通风量，但为时已晚，酶的活性减少1/3。

如果后期通风量减少到0.25VVm，就会导致产酶偏离正常范围。

可在黑曲霉生产酸性蛋白酶的时候，前期的通风量对酶的影响更为明显。

温度在黑曲霉生产蛋白酶的过程中也起着重要的作用，通常黑曲霉生产蛋白酶的温度控制在30℃。