蛋白质的疏水作用层析.docx
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蛋白质的疏水作用层析
第二部分药学生化实验
实验一.疏水作用层析
【实验目的】
通过实验了解疏水作用层析的原理与方法。
【实验原理】
疏水作用层析（HydrophobicInteractionChromatography，HIC）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。
蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。
不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。
疏水作用层析的基本原理如图所示。
L
+
H
S
L
H
S
+
W
P：
固相支持物
L：
疏水性配体
S：
蛋白质或多肽等生物大分子
H：
疏水补丁
W：
溶液中水分子
P
溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分子与疏水性层析介质之间的疏水作用。
利用这个性质，在高离子强度下将待分离的样品吸附在疏水性层析介质上，然后线性或阶段降低离子强度选择性的将样品解吸。
疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。
Phenyl-SepharoseTM6FastFlow是疏水性层析介质的一种，这种层析介质是以交联琼脂糖为支持物，交联琼脂糖支持物与苯基共价结合。
苯基作为疏水性配体，可以与疏水性物质发生疏水作用。
Phenyl-SepharoseTM6FastFlow结构示意图如下。
【实验材料】
1．实验器材
层析柱（1.6X20cm）；恒流泵；梯度混合器；试管及试管架；紫外分光光度计
2．实验试剂
（1）疏水层析介质：
Phenyl-SepharoseTM6FastFlow
（2）溶液A：
0.1MNa2HPO4,pH7.0
（3）溶液B：
0.1MNa2HPO4,pH7.0，1.7M（NH4）2SO4
（4）蛋白质样品溶于溶液B
【实验操作】
1.层析介质准备：
Phenyl-SepharoseTM6FastFlow疏水层析介质保存在20%乙醇中，取出层析介质后，倾出乙醇溶液。
加入溶液A，溶液的体积约占总体积的1/4。
2.装柱：
将层析柱洗净，固定在铁架台上，层析柱下口用螺旋夹夹紧。
加入溶液B，打开下口让溶液流出，排出残留气泡，柱中保留高度约2厘米的溶液。
将准备好的层析介质轻轻搅匀，用玻璃棒引流，沿层析柱内壁将层析介质缓慢加进柱中。
等到层析介质在柱中沉积高度超过1厘米时，打开下口。
柱床高度达到6-8厘米时关闭下口，装柱尽可能一次装完，避免出现界面。
3.柱平衡：
用溶液B平衡1-2个床体积。
注意始终保持层析介质处于溶液中，不要干柱。
4.上样：
取样品加入平衡好的层析柱，并收集层析柱下口流出组分，调节流速为1ml/min,每管3ml。
5.洗涤：
用溶液B洗涤1个床体积，洗去上样不吸附组分。
收集层析柱下口流出成分。
6.洗脱与收集：
梯度混合器左面装入250ml溶液A，右面装入250ml溶液B。
按照100%-0%1.7M（NH4）2SO4梯度洗脱500ml，收集洗脱液。
7.检测：
取各收集管样品，280nm处测定紫外吸收。
8.疏水层析介质清洗与保存：
层析介质先用水清洗，然后用0.5MNaOH洗脱，最后用水洗至中性。
处理好的层析介质放在20%乙醇中，4℃保存。
【实验结果】
以各个收集管的管号为横坐标，280nm处紫外吸收值为纵坐标作图，得到洗脱曲线。
分析实验结果并讨论。
【思考题】
疏水作用层析与反相层析有什么不同？
Experiment13HydrophobicInteractionChromatography
【Purpose】
Tounderstandtheprincipleandmethodofhydrophobicinteractionchromatography.
【Principle】
HydrophobicInteractionChromatography（HIC）isaversatilemethodforthepurificationandseparationofbiomoleculesbasedondifferencesintheirsurfacehydrophobicity.
Proteinsandpeptidesusuallysequesterhydrophobicaminoacidsindomainsawayfromthesurfaceofthemolecule.However,manybiomoleculesconsideredhydrophilichavesufficienthydrophobicgroupsexposedtoallowinteractionwithhydrophobicligandsattachedtothechromatographicmatrix.
Asshowninthefollowingfigure,substancesareseparatedonthebasisoftheirvaryingstrengthoftheirhydrophobicinteractionwithhydrophobicgroupsattachedtotheunchargedmatrix.
L
+
H
S
L
H
S
+
W
P：
Polymermatrix
L：
Ligandattachedtopolymermatrix
S：
Solutemolecule
H：
Hydrophobicpatchonsurfaceofsolutemolecule
W：
watermoleculesinthebulksolution
P
Hydrophobicinteractionbetweenabiomoleculeandthematrixisenhancedbyhighionicstrengthbuffers.Thistechniqueisusuallyperformedinthepresenceofmoderatelyhighconcentrationsofsaltsintheadsorptionbuffer.Elutionisachievedbyalinearorstepwisedecreaseinconcentrationofthesalt.
Phenyl-SepharoseTM6FastFlowisoneoftheHICmedium.InPhenyl-SepharoseTM6FastFlow,phenylgroupsasHICligandwhichhaveinteractionwithhydrophobicbiomoleculesarecoupledtothecross-linkedagarosematricesviaglycidyletherbonds（showninthefollowingfigure）。
【Materials】
1.Apparatus:
（1）Column（16/20）
（2）Pump
（3）Gradientmaker
（4）Ultravioletmeters
2．Reagents:
（1）Phenyl-SepharoseTM6FastFlow
（2）BufferA:
0.1MNa2HPO4pH7.0
（3）BufferB:
0.1MNa2HPO4pH7.01.7M（NH4）2SO4
（4）ProteinsamplesolvedinbufferB
【Procedure】
1.Preparingthegel
（1）Equilibrateallmaterialtoroomtemperature.
（2）Phenyl-SepharoseTM6FastFlowmediumissuppliedpre-swollenin20%ethanol.DecanttheethanolsolutionandreplaceitwithbufferAtoatotalvolumeof32.5ml（75%settledgel25%buffer）.
（3）Degastheslurryundervacuum.
2.Assemblingthecolumn
（1）Detailsofthecolumnpartscanbefoundintheinstructionssuppliedwiththecolumn.Beforepackage,ensurethatallparts,particularlythenets,netfastenersandglasstubes,arecleanandintact.
（2）Mounttheendpieceonthecolumnandcloseitwithastopper,addbufferBintothecolumn.Openthebottomoutletofthecolumntoletoutsomebufferstoensurethatthereisnoairbubblestrappedunderthenet.Closethecolumnwithastopper.
（3）FlushthecolumnwithbufferB.leavingafewmlatthebottom.Mountthecolumnverticallyonalaboratorystand.
3.Packingthecolumn
（1）Pourthegelslurryintothecolumninonecontinuousmotion.Pouringdownaglassrodheldagainstthewallofthecolumnhelpspreventtheintroductionofairbubbles.Filltheremainderofthecolumnwithbuffer.
（2）Mountthetoppieceonthecolumnandconnectitwiththepump.
4.Equilibration
（1）Openthebottomoutletofthecolumnandstartthepump.
（2）Toequilibrate,pumpapproximately100mlofbufferBthroughthecolumnataflowrateof1ml/min.ThecolumnisfullyequilibratedwhenthepHand/orconductivityoftheeffluentisthesameasbufferB.
5.Banding
（1）Appliedthesamplepreparedontotheequilibratedcolumn.
（2）Collectthesolutionswhichhasflownoutatafractionof3mlpertesttube
6.Wash
WashthecolumnwithbufferBtogetridofsamplesdonotbindandcollectthesolutionswhichhasflownout.
7.Elution
Elutethecolumnwithagradientform100%Bto100%A,totalvolumeis500mlandcollecttheelution.
8.Assay
Assaytheopticaldensityofthesampleinthetesttubesbyultravioletmeterat280nm.
9.Cleanofthemedium
（1）Aftereveryrun,washthecolumnwith50mlofdistilledH2O.
（2）Toremoveprecipitatedproteinsbywashingthecolumnwith80ml1MNaOHsolution,followedimmediatelywith50mlofdistilledH2O.
（3）Equilibratethecolumnwith20%ethanol.Themediumshouldbestoredin20%ethanolat4℃.
【Results】
TakethetesttubenumberedasXaxisandtheopticaldensityat280nmasYaxis,drawouttheelutecurve,andanalysistheresultanddiscuss.
【Questions】
WhatisthedifferencebetweenHICandreversephasechromatography?
蛋白质的疏水作用层析
S0730439蔡寅S0730440黄文睿S0730441黄彦
摘 要：
在众多的蛋白质分离纯化技术中,层析是一门关键技术,和其它分离技术相比,层析技术具有分离效率高、适用性广和过程易于放大、易于自动化的特点,因而得到了广泛的应用。
其中疏水作用层析作为蛋白质纯化中常用的一类层析技术，本文就其原理、层析介质的结构、种类、选择以及通过具体实例来对蛋白质的疏水层析技术进行了介绍。
关键词：
蛋白质；分离纯化；疏水作用层析
前言
疏水作用层析（HydrophobicInteractionChromatography,HIC）是采用具有适度疏水性的填料作为固定相，以含盐的水溶液作为流动相，利用溶质分子的疏水性质差异从而与固定相间疏水作用的强弱不同实现分离的层析方法。
它是自1948年Tiselius[1]发现疏水吸附现象之后逐渐发展起来的。
此后，由于疏水层析具有操作简单、蛋白质回收率高、蛋白质变性可能小、选择性强等优点而得到了广泛的应用。
如分离大豆凝集素[2]、纯化酶[3]等。
由于疏水作用层析的分离原理完全不同于离子交换层析或凝胶过滤层析等层析技术，使得该技术与后两者经常被联合使用分离复杂的生物样品，有关这方面的文献报道已非常多。
疏水作用层析对样品预处理方面的要求非常低，并且能够与传统的沉淀技术结合使用，使得该技术非常适合于整个纯化方案的早期阶段。
而由于该技术属于典型的吸附技术，介质对吸附物的结合容量也能达到比较满意，因此该技术还非常适合在大规模工业生产过程中采用，甚至还可以摒弃传统的柱层析形式而采用分批操作过程来对样品进行分离纯化。
一、蛋白质疏水作用层析的原理
1.1疏水作用层析的概念
疏水作用是一种广泛存在的作用，在生物系统中扮演着重要角色，它是球状蛋白高级结构的形成，寡聚蛋白亚基间结合、酶的催化和活性调节、生物体内一些小分子与蛋白质结合等生物过程的主要驱动力，同时也是磷脂和其他脂类共同形成生物膜双层结构并整合膜蛋白的基础。
蛋白质作为生物大分子，其亲水性或疏水性是相对的，即使是亲水性也会有局部疏水的区域，从而可能与HIC介质发生疏水作用，因此能够根据其疏水性的相对强弱不同进行分离。
蛋白质是由多种氨基酸组成，氨基酸根据其侧链的极性强弱可以分为亲水性氨基酸和疏水性氨基酸。
在形成球状蛋白质高级结构时，总体趋势是将疏水性氨基酸残基包裹在蛋白质分子内部而将亲水性氨基选残基分布在分子表面。
但实际上对于球状蛋白质而言，真正能完全包裹在分子内部的氨基酸侧链仅仅占总氨基酸侧链数的20%左右，其余均部分或完全暴露在分子表面。
蛋白质表面的疏水性是由暴露在表面的疏水性氨基酸的数量和种类，以及部分肽链骨架的疏水性决定的。
因而可以认为蛋白质分子表面含有很多分散在亲水区域内的疏水区（疏水补丁），它们在HIC过程中起着重要的作用。
然而研究表明，不同的球状蛋白质的疏水表面占分子表面的比例差异并不大，但即使是疏水表面比例非常接近的蛋白质，其在HIC中的层析行为却可能有很大的差别。
造成这一现象的原因是蛋白质分子表面的不规则性，即使是球状蛋白质，其分子表面也远非平滑球面，而是粗糙而复杂的，由于空间位阻的关系，有些疏水补丁是无法与HIC介质发生作用的，因此蛋白质在HIC中的层析行为不仅取决于分子表面疏水区的大小和疏水性的强弱，还取决于其疏水区在分子表面的分布。
盐类在疏水作用中起着非常重要的作用，高浓度盐的存在能与水分子发生强烈作用，导致可以在疏水分子周围形成空穴的水分子减少，促进了疏水性分子与介质的疏水配基之间发生结合。
因此在HIC过程中，在样品吸附阶段采用高盐浓度的溶液，使得目标分子结合在层析柱中，而在洗脱阶段，采用降低洗脱剂中盐浓度的方式使溶质与介质间的疏水作用减弱，从而从层析柱中解析而被洗脱下来。
较大的生物分子与介质发生结合时的情况时比较复杂的，一般来说每个分子被吸附的过程都会有一个以上的配基参与，换句话说，分子在介质上发生的结合是多点结合。
Jennissen[4]等人在研究磷酸化酶b与丁基Sephaose介质结合动力学时发现吸附过程是多步反应过程，其中的限速步骤并非酶与接着接触的过程，而是酶在介质表面发生缓慢的构象改变和重新定向的步骤。
1.2影响疏水作用层析过程的参数
1.2.1固定相
固定相条件，包括采用基质的类型、配基的种类和取代程度都会影响对样品的分离效果。
疏水配基类型和取代程度实际上决定了介质的疏水性强弱和结合容量的高低，配基（烷基）链长越长，取代程度越高，则疏水性越强；反之，链长越短，取代程度低，则疏水性越弱。
在HIC介质中，烷基配基的链长大多在C4～C8之间，苯基的疏水性大致与戊基相当，不过由于可能与溶质发生π-π相互作用，它与戊基有着不同的选择性，寡聚乙二醇固定相的疏水性界于丁基与苯基之间。
基质同样会对层析结果产生影响，具有相同配基种类和取代程度但不同基质的吸附剂会具有不同的选择性。
通常HIC介质所采用的是高度亲水性的基质。
1.2.2流动相
流动相条件对HIC的影响主要表现在所用盐的种类和浓度、流动相pH以及其他添加剂的影响。
有些离子存在于溶液中时会促进蛋白质发生沉淀，他们能够增加疏水作用；而另一些离子的存在却会促进蛋白质的溶解，它们的存在会破坏疏水作用。
表1中左边的离子能促进疏水作用因而经常在HIC中使用，而右边的离子属于促溶离子，它们能破坏疏水作用，有时在对介质进行清洗时可以用来洗脱一些结合特别牢固的杂质，从另一角度分析，盐类对疏水作用的影响与它们对溶液表面张力的贡献有关。
从自由能的变化来看，如果盐类的存在使得溶液的表面张力很大，则为了在疏水性溶质周围形成有规则的空穴所需输入的能量更大，或者说在热力学上更为不利，因此这类盐的存在能有效促进疏水作用。
表1不同离子对疏水作用强弱产生影响的Hofmeiser系列
←蛋白质沉淀（盐析）效应增加
阴离子：
PO43-,SO42-,CH3COO-,Cl-,Br-,NO3-,ClO4-,I-,SCN-
阳离子：
NH4+，Rb+，K+，Na+,Cs+,Li+,Mg2+,Ca2+,Ba2+
蛋白质促溶（盐溶）效应增加→
在盐的种类已经确定的情况下，盐浓度的高低会影响到溶质分子与介质的结合强度及介质的结合容量。
盐浓度的升高能促进疏水作用，因此HIC通常都是在高盐浓度下加样并完成吸附，而通过降低洗脱剂中盐浓度的方法进行洗脱。
流动相的pH对层析行为的影响比较复杂。
多数情况下pH升高会使得疏水作用减弱，而降低pH则增强此作用力，但是对于一些等电点比较高的蛋白质，在高的pH下却能够牢固的结合在HIC介质上。
Hjerten[5]等人研究了流动相PH的变化对若干蛋白质保留行为（用Ve/Vo来表示，其中Ve为各种蛋白质的洗脱体积，Vo为非滞留组分的洗脱体积）的影响，发现在pH5～8.5范围内pH的改变对蛋白质保留值的影响较小，而当pH＜5或pH＞8.5时流动相pH的改变会对保留值产生较大影响。
流动相中的其他添加剂主要指能够减弱疏水作用的醇类、去污剂、促溶盐类等，它们的存在能有效地将溶质分子从HIC介质上洗脱下来，同时它们还会影响分离过程的选择性。
但是它们的存在一般会破坏蛋白质的空间结构，使后者丧失部分或全部活性，所以在HIC过程忠尽量避免使用此类试剂。
1.2.3层析条件
除了固定相和流动相之外，层析过程中的一些其他条件，例如温度、流速等也会影响到层析结果。
其中温度因素比较复杂，疏水作用碎温度的升高而增强，但另一方面温度的升高会对蛋白质的构象状态和在水中的溶解性等产生影响，从而表现为复杂的特征。
二、疏水作用层析的介质
2.1疏水作用层析介质的结构
HIC介质的结构与其他吸附技术所用的吸附剂相类似，由作为骨架的基质和参与疏水作用的配基组成。
目前用于制备用途的HIC介质的基质主要有多糖类如琼脂糖、纤维素和人工合成聚合物类如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯类。
其中,半刚性的琼脂糖类凝胶仍是应用最广泛的疏水介质。
Gustavsson[6]等最近研制了超大孔（superporous）琼脂糖作为疏水层析介质的基质,在扩散孔的基础上增加了对流孔,传质速率快,能在流速较高的情况下获得较好的分辨率。
另外,由于壳聚糖具有良好的生物相容性和化学稳定性,近年来在疏水层析中也得到了应用[7]。
用于HIC介质的疏水配基很多,如羟丙基、丙基、苄基、异丙基、苯基、戊基、辛基等。
通常,配基通过稳定的非离子键（如醚键）与基质结合,图1列出了几种常用的配基结构及其与配基的联接方式。
图1 HIC介质的结构示意图
2.2疏水作用层析介质的种类
迄今为止,广泛使用的商品化制备型HIC介质配基仍是烷基和芳基,常见的商品化制备型HIC介质见表2[8]。
表2 主要的商品化制备型HIC介质
配 基
基质
粒径/μm
pH
配基密度
吸附容量/（mg/mL）
商品名
甲基（meth
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