氧化应激损伤后不同方法检测细胞线粒体膜电位变化的比较研究.docx

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氧化应激损伤后不同方法检测细胞线粒体膜电位变化的比较研究

论文题目：

氧化应激损伤后不同方法检测细胞线粒体膜电位变化的比较研究

摘要

我们对激光扫描共聚焦显微镜（laserscanningconfocalmicroscope，LSCM）、荧光板读板机和流式细胞仪（flowcytometer，FCM）在氧化应激诱导心肌H9C2细胞线粒体膜电位（Mitochondrialmembranepotential，ΔΨm）变化检测效果进行了比较。

利用透射电镜和线粒耗氧率分别检测线粒体形态和功能。

将H9c2细胞暴露于过氧化氢（Hydrogenperoxide，H2O2）（500、750、1000和1250μm）中以诱导线粒体氧化应激损伤。

通过LSCM、荧光读板机和FCM检测荧光探针（四甲基罗丹明乙酯（Tetramethylrhodamineethylester，TMRE）、5,5'、6,6'-四氯-1,1'、3,3'-四乙基苯并咪唑基氰碘化物（5,5´,6,6´-tetrachloro-1,1´,3,3´-tetraethyl-benzimidazolylcarbocyanineiodide，JC-1）和罗丹明123（Rhodamine123，R123））标记后ΔΨm的变化。

我们的数据表明，对于ΔΨm变化的动态检测，LSCM是最合适的检测仪器，而这三种仪器都能在端点处检测到ΔΨm的变化；TMRE和JC-1较R123更适宜ΔΨm的检测。

关键词线粒体膜电位；终点法；动态法；激光扫描共聚焦显微镜；荧光板读板机；流式细胞仪

Abstract

Weexaminedtheeffectsofoxidativestress-inducedchangesinmitochondrialmembranepotential（ΔΨm）inmyocardialH9c2cellsbylaserscanningconfocalmicroscopy（LSCM）,fluorescentplatereaderandflowcytometry（FCM）.Mitochondrialmorphologyandfunctionweredetectedbytransmissionelectronmicroscopyandmitochondrialoxygenconsumptionrate.CardiacH9c2cellswereexposedtoH2O2（500,750,1000,and1250µM）toinducemitochondrialoxidativestressinjury.ThechangeinΔΨmafterfluorescentlabelingincludingtetramethylrhodamineethylester（TMRE）,5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolocarbocyanineiodide（JC-1）,andrhodamine123（R123）wasdetectedbyLSCM,fluorescentplatereaderandFCM.OurdatashowthatLSCMisthemostsuitabledetectioninstrumentfordynamicdetectionofΔΨmchanges.AllthreeinstrumentscandetecttheΔΨmoftheendpoints;TMREandJC-1aremoresuitablefordetectingΔΨmthanR123.

Keywordsmitochondrialmembranepotential;dynamicmeasurements;endpointmeasurements;laserscanningconfocalmicroscope;fluorescenceplatereader;flowcytometer

AbstractII

第1章绪论

1.1本课题研究现状

线粒体广泛分布于人体的各个部位，是细胞的主要供能结构，人体大约有90%的能量由线粒体产生，线粒体结构与功能的正常对人体的生命健康至关重要。

线粒体由双层单位膜套叠而成，是细胞进行氧化供能的主要场所。

外膜是线粒体外层单位膜，镶嵌有多种跨越脂质双层的转运蛋白，使外膜出现直径2-3nm的小孔，允许分子量在10000D以下的物质通过。

内膜具有高度的选择通透性，膜上的转运蛋白严格控制内膜两侧物质的交换。

外膜将线粒体内部空间与细胞质分离，而渗透性较低的内膜将线粒体内部空间分为基质腔和膜间腔[1]。

线粒体内膜中的电子传递链同时充当质子泵，伴随着电子传递H+从线粒体基质转移到膜间腔，由于线粒体内膜对H+的不可透性，H+在膜间腔积累，进而产生线粒体膜电位[2]。

在细胞器中线粒体的结构和功能具有特殊性，这一因素导致线粒体易受周围环境变化的影响，出现肿胀、嵴的数目下降、融合、基质颗粒增加、氧化磷酸化能力下降等现象。

某些环境因素的改变可直接造成线粒体功能发生障碍，如出现线粒体DNA的复制和表达受抑、氧化应激、钙紊乱、线粒体通透性转变孔道开放等现象，进而引起一系列疾病，如：

糖尿病、常染色体显性视神经萎缩症、2A型腓骨肌萎缩症、阿尔兹海默症、线粒体脑肌病、心血管疾病、肿瘤等。

ΔΨm的降低是氧化应激诱导心肌细胞线粒体损伤的最早指标，这一损伤对于需氧量大的细胞尤为明显，它可释放细胞色素C并降低ATP的产生[1]。

因此，在一些心脏疾病中，准确、立即检测ΔΨm的变化非常重要。

过氧化氢是活性氧的一种，其化学性质较基态氧活泼，并且极易渗透进入细胞膜，接受一个电子生成羟自由基，引发细胞的氧化应激反应。

氧化应激产生的原因是细胞内活性氧过多或抗氧化物质减少，以至于细胞抗氧化能力不足，导致膜脂质过氧化增强，蛋白质功能抑制，核酸及染色体被破坏。

氧化应激被认为是导致细胞衰老和疾病的重要因素，该过程中产生的自由基可与各种细胞成分反应，引起细胞结构损伤和功能性代谢紊乱。

线粒体的氧化损伤主要表现为线粒体的损伤，进而造成细胞的衰老和死亡。

当线粒体损伤时，首先表现为线粒体膜去极化，ΔΨm降低。

常用于检测单细胞和分离线粒体ΔΨm的荧光探针，包括TMRE、JC-1和R123[3]。

由于其特殊的理化性质，线粒体很容易捕捉到这些探针，然后通过检测荧光强度来评价ΔΨm。

然而，尚不清楚这些探针是否会影响线粒体的正常结构和功能，或其对ΔΨm变化的测定是否存在差异。

在各种实验模型中，已经有许多仪器被用于观察ΔΨm，如激光扫描共聚焦显微镜、荧光板读板机和流式细胞仪。

激光扫描共聚焦显微镜进行线粒体膜电位检测时，激光器发射特定波长的单色激光作为光源，对样品焦平面进行扫描，得到一系列图像，最终通过光电二极管成像于显示器上。

荧光读板机可同时读取6到96孔微孔板的各种样品格式。

光源氙弧灯发出激发光，细胞在激发光下发射荧光，并照射到光电倍增管上，由其所发生的光电流经过放大器放大输出至记录仪。

流式细胞仪在进行线粒体膜电位检测时，氩离子激光束照射单列从流动室的喷嘴高速喷出呈单细胞液柱，细胞被激光照射后产生散射光。

检测系统将测得的光信号转为电信号，这些电信号经过加工处理储存于计算机中，用专门的计算机软件对其存储数据进行图像显示、分析即可反映线粒体膜电位的变化。

然而，每种仪器都有其检测的优缺点[3]。

因此，选择一种合适的方法来检测ΔΨm的重要性不容忽视。

在本研究中，我们评估了包括LSCM、FCM和荧光板读板机在内的三种仪器对氧化应激诱导的心脏H9c2细胞线粒体损伤过程中ΔΨm的影响。

1.2本文主要内容

实验分为三部分。

第一部分：

常规培养H9c2心肌细胞，用TMRE、JC-1和R123进行荧光标记，利用线粒体耗氧率和透射电镜分别检测线粒体功能和形态的变化。

第二部分：

检测各种强度的激光对细胞氧化应激的影响，将实验分为4组：

空白对照组，1250μMH202处理组，488nm激光组和543+488nm激光组。

用DCFH-DA进行荧光标记,然后用激光扫描共聚焦显微镜进行特定波长的激光照射实验。

第三部分：

制备氧化应激模型，将实验分为5组：

空白对照组，500μMH202处理组，750μMH202处理组，1000μMH202处理组，1250μMH202处理组。

用TMRE、JC-1和R123进行荧光标记。

然后用激光扫描共聚焦显微镜、荧光板读板机和流式细胞仪进行动态和端点法的检测。

1.3本章小结

本章主要介绍了线粒体的双层膜结构和ΔΨm的形成，H202产生的氧化应激作用，分析了ΔΨm的检测研究现状，最后对本文主要内容进行了介绍。

第2章材料与方法

2.1实验对象

大鼠胚胎心脏组织来源的H9c2细胞系购自美国ATCC公司。

健康成年雄性wistar大鼠（250-350g）购自斯贝福（北京）生物技术有限公司。

2.2实验试剂

磷酸盐缓冲液（PBS）、二甲基亚砜（Dimethylsulfoxide，DMSO）、DMEM培养基、JC-1和R123（BeyotimeBiotechnology，上海），TMRE（Invitrogen，美国），H2O2（Sigma，美国；批号STBB6350），线粒体耗氧率（OCR）检测试剂盒（SeahorseBiosciences，美国）。

2.3实验溶液配置

10×台式液：

精密天平称取4095mgNaCl、223.5mgKCl、47.605mgMgCl2和595.77mgHEPES用50ml的超纯水溶解配成10×台式液。

1×台式液：

吸取5mL的10×台式液，精密天平称取5.55mgCaCl2、52.2mgGlucose用50ml的超纯水溶解，调节PH为7.4，配成1×台式液。

TMRE（100nM）：

精密天平称取0.515mgTMRE粉剂用10mlDMSO溶解配成浓度为100μM的TMRE原液，使用时按照1：

1000的比例，用1×台式液稀释到100nM即可，避光保存。

JC-1（3.3µg/µL）:

吸取50μLJC-1（200X）加入8ml超纯水的比例稀释JC-1。

加入2mlJC-1染色缓冲液（5X），混匀，制成JC-1染色液，避光保存。

R123（2µM）:

将5mg的R123粉剂用6.565mlDMSO溶解配成浓度为2mM的R123原液,使用时按照1：

1000的比例，用1×台式液稀释到2µM即可，避光保存。

1250μMH202：

吸取30％的H202142µL，加858µLPBS至1mL。

1000μMH202：

吸取1250μMH202800µL，加200µLPBS至1mL。

750μMH202：

吸取1000μMH202750µL，加250µLPBS至1mL。

500μMH202：

吸取750μMH202667µL，加333µLPBS至1mL。

2%戊二醛：

吸取25％的戊二醛0.8mL，加4.2mL超纯水，再加5mL0.2mol/mL缓液，调节PH为7.4。

5mMCaCl2：

称取55.5mgCaCl2溶于100mL超纯水中。

1%四氧化锇：

吸取2％的锇酸水溶液10mL，加10mL0.2mol/mL缓冲液，调节PH为7.4。

2.4实验仪器

SeahorseXF24Analyzer

SeahorseBiosciences公司

透射电子显微镜

Hitachi公司

精密电子天平

民桥精密科学仪器有限公司

超纯水机

MilliporeMilli-Q

超低温冰箱

ThermoForma公司

37℃二氧化碳孵箱

ThermoForma公司

离心机

eppendorf公司

FV1000激光共聚焦显微镜

OLYMPUS公司

流式细胞仪

BD公司

荧光读板机

BioTek公司

2.5实验分组

实验分为三部分。

第一部分分组为：

①空白对照组（Control）：

正常心肌细胞；②TMRE组：

加入浓度为100nmol/L的TMRE处理20min;③JC-1组：

加入浓度为3.3µg/µl的JC-1处理20min;④R123组：

加入浓度为2µmol/L的R123处理20min。

第二部分：

①空白对照组（Control）：

正常心肌细胞；②H202处理组：

用浓度为1250μmol/L的H2O2处理H9c2细胞20min，孵育浓度为10μM的DCFH-DA染料30min，用488nm的激光激发；③488nm激光组：

孵育浓度为10μM的DCFH-DA染料30min，用488nm的激光激发；④543+488nm激光组：

孵育浓度为10μM的DCFH-DA染料30min，用543nm和488nm的激光激发。

第三部分分组为：

①空白对照组（Control）：

正常培养的H9c2细胞；②500μMH202处理组：

用浓度为500μmol/L的H2O2处理H9c2细胞20min；③750μMH202处理组：

用浓度为750μmol/L的H2O2处理H9c2细胞20min；④1000μMH202处理组：

用浓度为1000μmol/L的H2O2处理H9c2细胞20min；⑤1250μMH202处理组：

用浓度为1250μmol/L的H2O2处理H9c2细胞20min。

2.6细胞培养

1）细胞复苏与传代

将从液氮罐中取出的H9c2细胞于37℃恒温水浴箱中融化，在超净台内打开迅速用移液器转移到50mL培养瓶中，并吸取5mL含有10％胎牛血清（fetalbovineserum，FBS）和1％双抗的DMEM培养基悬浮细胞，然后拧紧瓶盖将培养瓶水平放置左右摇动使细胞分布均匀，放置在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度的培养箱中培养24-48h。

将具有良好生长状态良好贴壁超过90％的H9c2心肌细胞，用无菌PBS轻轻洗涤三遍，一次2ml，吸去多余PBS，加入细胞用0.25％胰蛋白酶200μL处理1-2min，当大量细胞从瓶底脱落时，加入15mLDMEM培养基并反复吹打，使其成为均匀细胞悬液传入三个培养瓶中每瓶5mL，培养24-48h。

如上所述细胞被传代至少3次，选择贴壁90％以上生长状态良好的心肌细胞进行实验。

用LSCM进行分析时，将细胞接种在恒温培养皿（1.5×105细胞/孔）中培养24小时。

用FCM分析时，将细胞接种在6孔板（1.5×105个细胞/孔）中培养24小时。

用荧光读板机分析时，将细胞接种在96孔板（1×104个细胞/孔）中培养24小时。

2）细胞冻存

将生长状态良好的处于对数生长期中且贴壁90％以上的H9c2心肌细胞，按照上述步骤将细胞消化下来，用移液器将细胞悬液转移到高压灭菌的离心管中，以1000r/min速率离心5min，用移液枪轻轻吸走上清后加入1000μL冻存液使细胞悬浮，充分混匀后，转移至1.5ml冻存管并拧紧瓶盖用封口膜密封，标记名称日期,梯度冻存，最后储存于-80℃冰箱中，如需长期保存最后转移到液氮罐中。

2.7线粒体分离和荧光探针培养

采集雄性Wistar大鼠（250-350g）心脏组织用于线粒体分离。

通过组织线粒体分离试剂盒（Beyotime）通过差速离心分离线粒体和细胞溶质部分，根据制造商的说明，分离的线粒体分别与TMRE（100nm）、JC-1（3.3μg/μl）或R123（2μm）培养20分钟。

2.8透射电子显微镜（TEM）分析

将H9c2细胞用2％戊二醛在含有5mMCaCl2的0.1M二甲胂酸盐缓冲液

（pH7.3）中于室温下固定1小时，之后用缓冲液冲洗两次，每次10分钟。

然后用1％四氧化锇和0.8％铁氰化钾在相同的缓冲液中于4℃下固定1小时。

将样品包埋在环氧树脂中。

用TopUltra150超薄切片机制备样品的超薄切片，并安装在300-μm网格铜网上，为每个样品制备至少三个网格。

最后在TEM下观察样品。

2.9线粒体耗氧率检测

如前所述[4]，通过SeahorseXF24分析仪测量OCR。

首先，将H9c2细胞（5×103/孔）铺在培养皿中并培养24小时。

然后，用补充有10mM葡萄糖和1mM丙酮酸的XF测定培养基（SeahorseBiosciences，100965-000）培养细胞，并置于不含CO2的37℃培养箱中1小时。

SeahorseXF24的自动化协议为：

11分钟的校准/平衡，然后将最佳浓度的药物/试剂同时注射到三个端口（混合3分钟，等待2分钟，测量3分钟）。

进行线粒体应激评估，端口装载有寡霉素（2μM），羰基氰化物-4-三氟甲氧基苯肼（0.3μM），鱼藤酮（4μM）和抗霉素A（4μM）。

在每个条件循环中，实时OCR平均被记录三次。

2.10线粒体ROS的测量

将H9c2细胞接种在特定温控培养皿（150,000细胞/孔）中，并在含有5％CO2的湿润培养箱（37℃）中与补充有DCFH-DA（10μM）的DMEM一起孵育30分钟。

然后将细胞固定在OlympusFV1000LSCM上。

用488nm氩-氪激光器激发DCF荧光，并通过525nm路径滤波器成像。

在整个实验过程中温度保持在37℃。

2.11测量TMRE荧光

TMRE是一种细胞渗透性阳离子红橙色荧光染料，易被活性线粒体螯合[5]。

用PBS将在培养皿或96孔板中培养的H9c2细胞洗涤两次，然后用TMRE（100nM）孵育20分钟。

之后，用PBS洗涤细胞两次，并在DMEM培养基中孵育。

使用LSCM分析时，TMRE的红色荧光通过氦-氖激光在543nm激发，并通过590nm滤光器成像。

用荧光板读板机分析时，激发波长为543nm，发射波长为590nm。

通过FCM分析时，在488nm的波长下激发荧光并收集在FL2通道中。

2.12测量JC-1荧光

JC-1是一种阳离子染料，在线粒体中可进行依赖性积累，其荧光发射可从绿色（529nm）转变为红色（590nm）[6]。

因此，线粒体膜电位的去极化程度可通过JC-1红/绿荧光强度比的降低来指示。

用PBS将在培养皿或96孔板中培养的H9c2细胞洗涤两次，然后用JC-1（3.3μg/μl）探针孵育20分钟。

之后，用PBS洗涤两次，并在DMEM培养基中温育。

使用LSCM分析时，单体和J-聚集体分别由488nm氩离子激光器和543氦-氖气体激光器激发，然后分别通过529和590nm路径滤光器成像。

用荧光板读板机检测单体和J-聚集体时，激发波长分别为488nm和543nm，发射波长分别为529nm和590nm。

通过FCM检测时，通过488nm氩离子激光器激发荧光并收集在FL1和FL2通道中。

2.13测量R123荧光

R123是一种阳离子绿色荧光染料，可渗入细胞，易被活性线粒体分离，无细胞毒作用，无细胞毒性作用[7]。

在培养皿或96孔板中培养的H9c2细胞用PBS洗涤两次，然后与R123（2μM）温育20分钟。

再用PBS洗涤细胞两次，然后在DMEM培养基中孵育。

使用LSCM分析时，R123的绿色荧光由488nm氩离子激光器激发，并通过529nm路径滤光器成像。

用荧光读板机分析时，激发波长为507nm，而发射波长为529nm。

用荧光板读板机分析时，荧光由488nm氩离子激光器激发并在FL1通道中检测。

2.14实验方案

进行端点测量时，将在培养皿或96孔板中培养的H9c2细胞分为对照组和H2O2（500,750,1000和1250μM）组。

处理后，向细胞中加入上述荧光探针孵育一定时间，然后通过LSCM，荧光读板机和FCM检测荧光强度。

进行动态测量时，将在培养皿或96孔板中培养的H9c2细胞与如上所述的各种荧光探针一起温育。

然后，用PBS洗涤培养的细胞两次，然后在DMEM培养基中孵育。

将细胞分成对照组和H2O2（500,750,1000和1250μM）组。

通过LSCM和荧光板读数器每分钟测量一次ΔΨm持续20分钟。

为了观察到ΔΨm在LSCM下的动态变化，使用×40油浸物镜（NA：

1.3），每个激光器的透射率为4％，PMT电压为450.共聚焦显微镜系统提供的扫描速度为8微秒/像素。

2.15统计分析

重复试验收集数据，使用SPSS17.0软件进行统计分析，结果以平均值±标准差表示，多组比较用完全随机设计单因素方差分析，两两比较用t检验分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

第3章结果和讨论

3.1不同荧光探针对心肌H9c2细胞及线粒体形态结构及功能的影响

3.1.1不同荧光探针对H9c2心肌细胞和线粒体形态的影响

图1不同荧光探针对H9c2细胞和线粒体形态的影响

Fig.1EffectsofdifferentfluorescentprobesonH9c2cellsandmitochondrialmorphologyandfunctions

图1（A）Control:

通过透射电子显微镜（TEM）观察的正常H9c2细胞的超微结构。

红色箭头表示线粒体。

TMRE、Jc-1、R123:

三种荧光探针对线粒体大小的影响。

（B）:

三种荧光探针对线粒体大小的影响。

平均值±SD（n=5）。

如图1A所示，在用不同荧光探针染色后，细胞膜结构完整，具有完整清晰的核膜和形态正常的线粒体，且线粒体大小无显著差别（图1B），表明不同荧光探针对细胞及线粒体形态无显著影响。

3.1.2不同荧光探针对线粒体功能的影响

图2不同荧光探针对线粒体耗氧率的影响

Fig.2Effectsofdifferentfluorescentprobesonmitochondrialoxygenconsumptionrate

图2A:

测量线粒体氧消耗率（OCR）的实时测量的实例。

B:

三种荧光探针对线粒体呼吸的影响。

在用TMRE，JC-1或罗丹明123处理20分钟后，在H9c2细胞中测量OCR。

平均值±SD（n=5）。

*与对照组相比，p<0.05。

如图2A和2B所示，与对照组相比，三种荧光探针对线粒体的基础呼吸和ATP合成无显著影响，而线粒体的最大耗氧量会有不同程度的减少。

3.2LSCM激光对细胞氧化应激的影响

图3用DCFH-DA检测H9c2细胞中总ROS的产生

Fig.3DCFH-DAwasusedtodetecttotalROSproductioninH9c2cells.

图3除对照组外，细胞用DCFH-DA（10μM）染色。

将细胞用H2O2（1250μM）在H2O2组中处理20分钟。

所有组每分钟通过LSCM488nm激光激发，持续20分钟，而488+533nm组中的细胞同时接受两次激光激发。

为了验证在本实验条件下，不同波长激光是否加重细胞的氧化应激损伤，我们对细胞产生的活性氧进行了检测。

如图3所示，与对照组相比，阳性对照H2O2（1250μM）组的DCF荧光强度明显增加，而488nm，488nm和543nm激光组没有引起DCF荧光强度的显著变化，表明在本实验的激光强度和模式下，并未加重细胞的氧化应激损伤。

3.3不同方法检测氧化应激后H9c2细胞线粒体膜电位变化

3.3.1用LSCM检测ΔΨm

图4用LSCM观察到的氧化应激引起的ΔΨm的变化

Fig.4ChangesinΔΨmca