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荧光法测定油菜中的维生素E
密级公开学号201240600133
衡水学院
毕业论文（设计）
荧光法测定油菜中的维生素E
论文作者
：
程青青
指导教师
：
周晓霞
系别
：
：
应用化学系
专业
应用化学
年级
：
2012级
提交日期
：
2016年5月20日
答辩日期
：
2016年6月1日
毕业论文学术承诺
本人郑重承诺：
所呈交的毕业论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不存在抄袭情况，论文中不包含其他人已经发表的研究成果，也不包含他人或其他教学机构取得的研究成果。
作者签名：
日期：
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即：
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作者签名：
指导教师签名：
日期：
日期：
论文题目：
荧光法测量油菜中的维生素E
摘要：
本实验采用荧光法为测定方法，对油菜中的维生素E含量进行测定。
荧光光度法利用维生素E吸收较短波长的光能后发射较长波长特征光谱的性质，对其进行定性或定量分析。
本实验通过单一变量法对实验条件进行控制，进而探讨对油菜的不同浸泡时间、萃取液的不同pH、不同温度等实验条件对实验结果的影响。
实验表明，对油菜的浸泡时间为25min效果最好，超过此时间维生素E会受到空气的氧化；测量最佳pH为2.0；水浴的温度应为75℃，低于此温度不利于维生素E的浸出。
使用荧光法所得最佳参数为：
激发波长（ex）:
293nm,发射波长（em）:
324nm。
标准曲线方程I=16.488ρ+1.1138，I为荧光强度，ρ为质量浓度，相关系数r为0.9986，检出限为0.0030mg·L-1。
该方法选择性好，灵敏度高。
关键词：
荧光法；维生素E；油菜
Title：
TheStudyAboutVitaminEContentinRapeWiththeMethodofFluorescence
Abstract:
ThevitaminEofrapeinthisexperimentisevaluatedbyfluorescencemethod.vitaminEisabletoabsorbtheenergyoflightwhichchangeshorterwavelengthintolongerwavesandmakeananalysisofitsqualityandnature.Thisexperimentiscontrolledbysinglevariablemethodexploringfactorssuchasdifferentsoakingtimeofrape,pHandtemperatureinfluencingtheresultsofexperiment.Ittakes25minutetoimmerserape,whichisenough.Otherwise,vitaminEcouldbeoxidizebyairifthetimeisalittlelongerthantheregulartime.ThesuitablepHis6.5.Itisn'tgoodforvitaminE'sleachingifitisbelowthetemperatureofwaterbath.Thebestparametersareexcitationwavelengthequals263nmandemissionwavelengthequals324nm.ThestandardequationisI=16.488ρ+1.1138，Iisfluorescence,ρismassconcentration,thecorrelationis0.9986,detectionis0.0030mg·L-1.Themethodhasgoodselectivityandhighsensitivity.
Keywords:
Fluorescencemethod;VitaminE;rape
1绪论
1.1维生素E的理化性质和用途
维生素E是一种粘稠状液体，呈微黄色或黄色透明，是一种脂溶性维生素，根据相似相溶原理，维生素E易溶于有机溶剂中，例如无水乙醇、丙酮、乙醚、石油醚、正己烷中，在水中则不易溶。
天然的维生素E（又称生育酚）多存在于绿色植物的油脂中，是一种组成较为复杂的混和物。
维生素E作为一种抗氧化剂及营养剂其性能十分优良，同时又具有食用安全、生物活性高的特点[1]，在医药、保健品、食品、化妆品等领域有着极为广泛的应用，近年来成为倍受关注的热点产品。
维生素E是到目前为止科学家所发现的唯一一种对身体无毒害的油脂类食品的天然抗氧化剂，它由8种异构体（α、β、γ、δ生育酚和三烯生育酚等）构成，不溶于水，易溶于多种有机溶剂[2]。
维生素E在隔绝氧气的条件下对热相对是稳定的，加热温度达到200℃也不发生结构上的破坏，但对氧十分敏感，在和空气接触的条件下可以被氧化。
维生素E是高效的抗氧化剂，在食品、医疗、化妆品方面有着重要应用[3]。
维生素E在身体内可以保护组织细胞免受自由基损害，具有很好的抗氧化作用；因此，维生素E可以起到预防衰老，促进身体内蛋白质更新及合成的作用[4]；此外，进一步的研究表明维生素E还与动物的精子生成和生殖功能有关，并具有调节血小板粘附力和聚集的作用；维生素E有时候能起到代替微量元素硒，提高人体免疫力，抑制肿瘤细胞的作用。
近年来，维生素E的研究逐渐为人们所关注，对其检验方法、定量分析方法也逐渐成为人们关注的焦点。
1.2测定油菜中维生素E含量的方法
维生素E作为一种在多个领域用途广泛的营养物质和药用物质，常被用于改善人体内分泌、血管疾病和美容等方面并取得了较为满意的效果。
油菜是我国人民较常食用的一种蔬菜。
油菜中维生素E含量的测定和研究，对病理学、营养学、临床医学和人民的膳食生活水平的改善都有着重要的意义。
进入20世纪以来，维生素E的研究方法日益增多，越来越受到研究学者的重视。
其分析方法和技术也日趋完善、成熟。
李英丽等[5-7]论述测定维生素E常用的分析方法有紫外分光光度法、荧光光度法、高效液相色谱法、生物测定法、比色法、铈量法、近红外光谱法、气相色谱法等。
国外Mehboall[8]等已经使用比色法测定了维生素E在血液中的含量，其使用联苯菲啰啉为显色剂，FeCl5做氧化剂，该方法不但成本低，且简单实用，测定20份样本只需要不到2h。
国外Tutem等[9]则以新亚铜试剂为显色剂，CuCl2为氧化剂在450nm处测定药用试剂中维生素E的含量，测定的结果表明CuCl2做氧化剂时反应条件比较温和，而且还能够克服样品中所含有的某些还原剂如维生素C的干扰，测定结果与FeCl5--联苯菲啰啉比色法及HPLC法相比并无显著性的差异，以此证明此比色法可以作为实验室对维生素E分析的常规方法。
气相色谱法是一种对多组分混合物适用的定性定量分析方法[10]。
此法具有不但高度的选择性，且集分离和测定于一体。
可以具有选择性的对维生素E及其异构体进行测定。
测定时多采用内标法，测定结果不受操作条件和进样量的影响。
中国药典多采用气相色谱法。
刘悍[11]等阐述了电化学测定的原理：
在碳和电极上维生素E分子上的酚羟基会发生会被不可逆的氧化，其氧化还原电势可测。
维生素E分子所具有的这种电化学特性是电化学法测定待测物质中维生素E含量的原理。
这种检测方法比高效液相色谱法还要快速。
本实验对油菜中维生素E的测定所采用的方法是荧光法。
一般情况下荧光法的检测下限可以达到0.1~0.001μg·mL-1。
因此，荧光法具有较高的灵敏度，是目前最灵敏的分析检测技术之一。
此外，荧光法具有较好的选择性和物质鉴定能力，因为荧光分析法能够同时兼顾荧光发射光谱和激发光谱。
但是，由于待测物质的化学结构需要满足荧光分析方法的特殊要求使得荧光分析法的通用性不如紫外可见分光光度法。
测定维生素E的其他方法中使用色谱法装置比较复杂，步骤繁琐，不适合用于大量样品的测定，分光光度法干扰因素较多，准确性相对较差[12]。
程功等[13]红外光谱法吸收强度较弱，谱带较宽用于维生素E的测定具有低成本、快速、简便的优点，但主要用于成分单一、干扰少的植物油中维生素E的测定。
本实验采用荧光光度法利用维生素E吸收较短波长的光能后发射较长波长特征光谱的性质，对其进行定性或定量分析。
可以从发射光谱或激发光谱进行分析。
该法灵敏度高，选择性好且简便、快捷。
1.2.1荧光法
荧光法是测定维生素E含量的一种常见方法。
到目前为止荧光法是最灵敏的分析技术之一，具有较高的灵敏度。
近年来，荧光分析技术的方法和理论不断完善，荧光分析仪器持续发展已经使得荧光分析法成为一种重要的光谱分析方法。
荧光现象是一种由光导致的发电发光现象，由于维生素E分子对光具有选择性吸收，使不同波长的激发光具有不同的激发效率。
当维生素E分子受到不同波长的入射光的激发，并且在固定的波长处测量激发出来的荧光强度，在绘制光谱曲线时，以荧光强度为纵坐标，以激发强度为纵坐标所绘制出的光谱为维生素E的荧光激发光谱。
当绘制维生素E荧光发射光谱时，保持激发光的强度和波长不变，测量维生素E在不同波长处发射的荧光强度，再绘制荧光强度随发射波长变化的关系曲线。
在激发光谱中最大激发波长所对应的点是光谱中曲线的最高点。
该波长所对应的光具有最强的激发能力。
在激发光谱中最大发射波长所对应的点是激发光谱中的最高点。
1.3本实验研究内容
本实验主要内容为测定油菜中的维生素E，所用的方法是荧光法。
荧光法具有选择性好，灵敏度高的优点。
本实验通过单一变量法对实验条件进行控制，进而探讨对油菜的不同浸泡时间、萃取液的不同pH、不同浸泡温度等实验条件对实验结果的影响。
通过对得出的荧光谱图和数据进行分析进而确定出最佳的反应温度、萃取液的pH和对油菜的浸泡时间。
在实验进行的过程中，使用经过洗涤、干燥的油菜做样品，经过萃取得到萃取液后，对萃取液进行荧光测定，根据荧光测定得到的数据，探讨对油菜的不同浸泡时间、萃取液的不同pH、不同浸泡温度等实验条件对实验结果的影响。
并依次绘制出油菜浸泡时间和维生素E荧光强度关系图、不同pH萃取液同维生素E荧光强度关系图、不同提取温度和维生素E荧光强度关系图，分别得出了对油菜进行浸泡的最佳时间、荧光测定的最佳pH和对油菜的最佳提取温度，同时通过测定不同浓度系列维生素E的无水乙醇溶液绘制出维生素E的标准曲线。
通过对维生素E标准曲线的拟合，得出了回归方程和相关系数。
结果表明维生素E溶液浓度小于10mg·L-1时与荧光强度呈现较好的关系。
2实验部分
2.1实验仪器与试剂
2.1.1主要仪器
表2-1实验主要仪器
仪器名称
型号
生产厂家
日立荧光分光光度计F-4500
722
上海光谱仪器有限公司
电子天平
FA2004N
上海精科仪器有限公司
容量瓶
50mL
广东顺德美的电器有限公司
分析天平
UW4200S
上海精科仪器生产有限公司
移液管
1mL
苏州柏科仪器有限公司
电恒温水浴锅
HH-2
重庆四达实验仪器有限公司
2.1.2主要试剂
实验药品
规格
生产厂家
抗坏血酸溶液
AR.
天津天大化学试剂有限公司
氢氧化钠溶液
AR.
西安化学试剂厂
盐酸溶液
AR.
西安化学试剂厂
无水乙醇
AR.
济南试剂总厂
无水乙醇
AR.
石家庄化工厂
无水乙醇
AR.
北京化工厂
无水硫酸钠
AR.
广西百合化工厂
重蒸水
AR.
济南清岸化工厂
维生素E标准液
AR.
北京科华新技术有限公司
表2-2实验主要试剂
2.1.3样品
油菜（购自衡水学院东家园超市）
2.2荧光法
2.2.1溶液的配制
（1）抗坏血酸溶液（2.5％）：
用吸量管准确量取抗坏血酸2.50mL于100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，避光保存备用。
（2）氢氧化钠溶液（50％）：
准确称取药品氢氧化钠50g于烧杯中，用50mL蒸馏水溶解，转移至容量瓶中，定容，留待使用。
（3）盐酸溶液（0.1mol·L-1）：
准确移取分析纯浓盐酸8.5mL，用二次蒸馏水稀释至1000mL[14]。
（4）维生素E标准溶液：
吸取0.50mL母液，用无水乙醇定容至10.00mL,避光保存。
2.2.2样品的处理
1、样品的处理：
准确称取经过洗涤、干燥、粉碎的油菜样品大约1.5000g，放入50mL棕色容量瓶中，加入2.00mL的2%抗坏血酸溶液，5mL的2mol·L-1盐酸，20mL无水乙醇，在65℃水浴中恒温振荡25min，取出在流水下冷却至室温。
2、皂化：
在上述容量瓶中加人1.0mL55%氢氧化钾溶液，在65℃水浴中恒温振荡20min，取出在流水下冷却至室温，加入5.0mL蒸馏水，摇匀，用无水乙醇定容至50mL。
3、提取：
移取上述容量瓶皂化液5.00mL于20mL棕色带塞试管中，加入5.0mL无水乙醇（30一60℃）振荡1min，静置，待分层后（如有乳化现象，加少许无水乙醇），用注射器移去下层，上层无水乙醇液分别用蒸馏水洗涤2-3次，即可用于测定。
2.2.3标准曲线的绘制
准确移取维生素E标准溶液0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00、12.00mL至100mL容量瓶中，用无水乙醇定容，编号1、2、3、4、5、6、7，浓度分别为0.000、2.000、4.000、6.000、8.000、10.00、12.00μg·mL-1各取10.00mL，置比色管（编号1、2、3、4、5、6、7）中，立刻进行测量。
测量结果如图：
荧光强度
浓度（mg·L-1）
维生素E标准曲线
经测定不同质量浓度的维生素E溶液，得出回归方程I=16.488ρ+1.1138，I为荧光强度，ρ为质量浓度，相关系数r为0.9986，检出限为0.0030mg·L-1。
2.2.4维生素的激发光谱和发射光谱
准确量取维生素E的标准液1mL于10mL比色管中，使用无水乙醇定容。
然后，将比色管中的溶液倒入荧光比色皿中，用擦镜纸擦去比色皿外侧溶液，打开仪器盖，将比色皿放入仪器，盖好盖子。
开始测量。
测量时，固定其他实验条件及发射波长，只改变激发波长，测量得到维生素E的激发光谱。
然后，固定激发波长在维生素E最强激发波长295nm处，固定其他实验条件，改变发射波长，测量维生素E的荧光发射光谱[15]。
实验测得最佳激发波长（ex）:
293nm,最佳发射波长（em）:
324nm。
荧光强度
λ/nm
图2-1维生素E激发光谱
荧光强度
λ/nm
图2-2维生素E发射光谱
2.2.5最佳萃取时间的选择
准确称取经过洗净、烘干的油菜五等份，按照2.2.2的处理方法，保持其他实验条件不变，水浴时间分别控制在10min、15min、20min、25min、30min,得出的维生素E提取液分别进行荧光测定，根据所得到的荧光强度数据绘制油菜水浴处理时间和荧光强度的关系。
实验发现对油菜进行萃取的最佳时间为25min。
荧光强度
λ/nm
图2-3浸泡时间与荧光强度关系图
2.2.6维生素E荧光测定最佳酸度的测定
取七只比色管编号，在七只比色管中各移取1mL维生素E标准液，使用0.1mol·L-1盐酸调节pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，调节完成后，放入荧光测量池进行荧光测定。
根据荧光测定的数据，绘制出荧光强度与萃取液pH的关系曲线。
测定结果表明最佳pH=2.0。
荧光强度
pH
图2-4pH与维生素E荧光强度关系图
2.2.7最佳水浴温度的测定
按照2..2.2的样品处理方法，保持其他实验条件固定，水浴温度分别控制为65℃、70℃、75℃、80℃、85℃，将得出的维生素E萃取液放入荧光测量池进行测定。
根据测量数据绘制水浴温度和维生素Ｅ荧光强度关系曲线，实验结果表明最佳水浴温度为75℃。
荧光强度
温度（℃）
图2-5温度与维生素E荧光强度关系图
2.2.8样品中维生素E含量的测定
在按照2.2.2的样品处理方法，控制实验水浴时间25min，水浴温度保持在75℃，荧光测定时pH调节为2.0。
提取出维生素E萃取液后，在295nm处进行荧光测定。
记录样品重量m1荧光强度I1。
对上述样品液完成荧光测定后，再按照2.2.2的样品处理方法准备空白液（不加油菜，控制实验水浴时间25min，水浴温度保持在75℃，荧光测定时pH调节为2.0），在295nm处进行荧光测定。
记录空白液的荧光强度I0。
最后，记录维生素E标准品用量m2，在295nm处对标准液进行荧光测定，记录标准液的荧光强度I2。
根据所得数据计算油菜中维生素E的含量。
计算公式采用阴季悌[16]：
维生素E含量（mg·g-1）：
I0-----空白试剂的荧光强度
I1-----样品液的荧光强度
I2-----标准维生素E溶液的荧光强度
m1-----样品重量
m2-----标准维生素E重量
3结果与讨论
3.1荧光法测定结果
3.1.1荧光法法测定油菜中维生素E含量的结果
采用荧光法对油菜中维生素E含量进行测定，测得100g油菜中含有12.46mg维生素E。
表3-1荧光法测定油菜样品中维生素E的含量
序号
1
2
3
样品重量m1/g
1.5000
1.5004
1.5002
标准维生素E重量m2/mg
0.1669
0..1681
0.1679
I0
12
12
12
I1
123.6
123.9
123.7
I2
111.9
120.1
120.0
维生素E含量
12.42
12.54
12.50
维生素E平均含量mg/100g
12.46
RSD%
0.62
3.1.2荧光法测定油菜中维生素E加标回收率的结果
表3-2荧光法测定油菜中维生素E的加标回收率
编号
样品维生素E含
量（mg/100g）
加标量（mg）
测定量（mg/100g）
回收率（%）
平均回收率（%）
1
12.42
100
108.5
96.11
95.53
2
12.54
100
107.8
95.28
3
12.50
100
107.7
95.20
由上表可知，使用荧光法测定油菜中维生素E的含量，平均加标回收率为95.53%。
荧光法测定维生素E的RSD大于1，说明其方法可行，且仪器简便。
结语
维生素E是一种用途广泛的营养物质。
其被广泛用于改善人体内分泌，血管疾病和美容等方面。
油菜是我国人们较常食用的一种蔬菜。
油菜中维生素E含量的检测和研究，对营养学、病理学、临床诊断和人民的膳食生活都有着重要的意义。
在荧光法测定油菜中的维生素E含量的试验中，容易影响实验结果准确度的主要因素包括对油菜的浸泡时间、进行荧光测量的维生素E提取液pH以及水浴的温度。
荧光法测定油菜中的维生素E时，在对油菜的提取过程中要均匀的摇晃，否则会影响维生素E的提取效果，导致实验结果偏低[17]。
由于维生素E和空气接触会被氧气氧化，因此，在实验的过程中加入一些还原剂是必要的，本实验采用抗坏血酸溶液做还原剂。
能够很有效的避免维生素E被氧化。
在对油菜的处理过程中，皂化时容易产生浑浊，静置处理就会分层，能得到澄清的维生素E提取液。
从而得到正确的实验结果。
经测定不同质量浓度的维生素E溶液，得出当维生素标准液浓度在0-10mg·L-1范围内，浓度和荧光强度成交好的线性关系，回归方程为I=16.488ρ+1.1138，I为荧光强度，ρ为质量浓度，相关系数r为0.9986，检出限为0.0030mg·L-1。
本实验的实验结果表明在75℃，对油菜提取25min，将所得提取液pH控制为2.0，能得出油菜中维生素E的含量为12.46mg·100g-1。
荧光法该法灵敏度高，选择性好且简便、快捷。
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致谢
在论文即将完成之际，我向曾经给予我帮助和支持的人表示衷心的感谢。
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